Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1
Шрифт:
Генетическая обусловленность процессов морфогенеза отражается в изменении синтеза и-РНК, белков, активных ферментов, то есть в комплексе скоординированных во времени и пространстве реакций, обуславливающих дифференциацию активности генов. Появление некоторых белков свидетельствует об их участии в морфогенезе и запуске морфогенетических реакций. Установлен специфический фактор пептидной природы, стимулирующий морфогенез. Изучая генетический контроль каллусообразования и органогенеза, ученые предположили, что интенсивность образования каллуса находится под генетическим контролем.
О генетической обусловленности признака регенерации в условиях in vitro свидетельствуют следующие факты:
1. Отсутствие определенных плеч
2. С помощью гибридизации можно повысить интенсивность регенерации в каллусной ткани.
3. Использование разных по составу питательных сред для регенерации способствует разному уровню экспрессии генов, которые определяют этот признак.
4. В основе генетического контроля таких признаков, как частота каллусообразования, частота образования морфогенных каллусов и количество зон регенерации для озимой пшеницы основными являются сверхдоминирование, неполное доминирование и эпистаз; для озимой твердой — эпистаз, неполное доминирование и сверхдоминирование; для яровой твердой — эпистаз.
Одни генетические системы контроля для всех признаков проявляются стабильно (эпистаз), а другие (сверхдоминирование) — значительно изменяются в зависимости от признаков и генотипов. Но следует отметить, что каллусогенез и регенерация растений не являются сопряженными процессами, вероятно, они контролируются различными генетическими механизмами. Общей закономерностью для культивируемых тканей остается возрастание цитогенетической вариабельности в процессе культивирования. С этим коррелирует в большинстве случаев потеря морфогенного потенциала. Способность к морфогенезу зависит и от состояния ядра. Как правило, регенерирующие в культуре тканей растения являются диплоидными, хотя ткани, из которых они произошли, имеют разный уровень плоидности.
Таким образом, для индукции морфогенеза in vitro необходимо вызвать неоднородность в клеточных популяциях и тканях. Любые воздействия, приводящие к увеличению неоднородности в культуре клеток, в пространственном распределении гормонов, будут способствовать дифференциации клеток и формообразованию в каллусе. Доказательством этого могут также служить эксперименты, проведенные с каллусной тканью пшеницы и кукурузы в космических условиях. Эти эксперименты были описаны М. Карабаевым (1994). В условиях космического полета можно выделить 2 принципиальных стадии клеточного ответа на экстремальные условия:
1. Эта стадия, или стадия адаптации, продолжается 10–12 дней и связана с адаптацией культуры к стрессу. Она сопровождается общим уменьшением жизнеспособности клеток и потерей значительного числа клеток. В этих условиях число жизнеспособных, стрессоустойчивых клеток постепенно возрастает.
2. Инициируется деление и меняется распределение клеток в популяции, уменьшается градиент элементов питательной среды, так же как и градиент продуктов жизнедеятельности клеток. Независимо от продолжительности космического поле та, развитие клеток и структур, ответственных за клеточную дифференциацию, эмбриогенез и регенерацию растений подавляется космическими условиями. Основная причина этого может быть связана со специфическим распределением клеток в клеточной популяции и слабостью межклеточных контактов под действием невесомости. Анализ этих данных позволяет заключить, что гравитация имеет большое значение для развития растений, так как условия Земли способствуют более тесному взаимодействию гетерогенных спорадично растущих клеточных структур, а это впоследствии влияет на индукцию клеточной дифференциации.
Суспензионные культуры
Суспензионные культуры — отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно
Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии:
— высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);
— морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
— отсутствие трахеидоподобных элементов.
Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100–120 об/мин. При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1–2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2–3 г свежей массы каллусной культуры на 60-100 мл жидкой питательной среды. Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.
Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:
1. Объем осажденных клеток (ООК). Переносят небольшой объем суспензионной культуры в мерную пробирку объемом 15 мл, лучше всего коническую. Центрифугируют 5 минут при 200 д. ООК — величина, которую составляет объем осадка от объема суспензии, обычно в %.
2. Число клеток. Подсчитывается в камере Фукса-Розенталя.
3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется через смоченный и взвешенный фильтр, вложенный в воронку Бюхнера под слабым вакуумом. Клетки промывают дистиллированной водой, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром. Сухая масса — определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат вместе с фильтром в термостате при 60 °C до постоянной массы.
4. Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70 % этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85 °C полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок по Лоури.
5. Проводимость среды. Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.
6. Жизнеспособность клеток. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса). Перед использованием подбирают pH инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.
По полученным данным строят ростовые кривые, которые имеют S-образную форму и состоят из нескольких участков: 1 — латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается ни по одному из критериев; 2 — экспоненциальная, рост с ускорением; 3 — линейная, где скорость роста постоянна; 4 — фаза замедленного роста; 5 — стационарная фаза; 6 — фаза деградации клеток (рис. 11)[68].
Реальная ростовая кривая может несколько отличаться от модельной. На форму ростовых кривых влияют и генетическая характеристика популяции (вид растения), и количество инокулята, и условия выращивания (состав среды, начальное значение pH, состав газовой фазы, скорость перемешивания).