Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Журнал «Домашняя лаборатория»

От редакции

Установка капиллярного электрофореза показалась нам достаточно простой для воспроизведения в условиях домашней лаборатории. Следует также учесть, что прототипами большинства фирменных установок являлись кустарные и полукустарные разработки научных сотрудников и изобретателей. И они работали. До уровня совершенства их, как правило, доводили инженеры компаний, выпускающих научное оборудование.

В отношении этого метода можно отметить, что:

• Практически не требуется специализированных реагентов.

• Основным расходным материалом являются буферные соли — бораты, фосфаты, ацетаты, SDS, 0.1М NaOH и 0.1М HCL, флуоресцентный маркер, если работе ведется с лазером, и капилляр.

• Капилляр многоразовый и

служит дольше колонки HPLC, легче регенерируется, может быть вытянут самостоятельно из кварцевой трубки.

• Разрешающая способность капилляра значительно выше

• Даже при очень интенсивной работе расходуется 10–20 миллилитров буфера в день.

• Все буферные растворы легко изготавливаются в любой лаборатории,

• Рабочая чувствительность при комплектации лазерным флуориметром достигает -12М.

• Специальные микропробирки позволяют работать с пробами по 5-10 мкл. На анализ забирается не более! — 0,1 мкл пробы.

В РЕЗУЛЬТАТЕ ПО СРАВНЕНИЮ С ВЭЖХ:

• Расходы на растворители, реагенты и пробоподготовку в 50-200 раз ниже.

• Трудоемкость в 3–5 раз меньше.

• Производительность (проб/день) на 15–20 % выше.

• Обслуживание проще (нет движущихся деталей).

• Проба остается цела!

1. Введение

Такие аналитические методы, как хроматография и электрофорез, находят широкое применение в определении состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды и промышленной продукции.

Методы газовой хроматографии (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяют за короткое время проводить разделение, идентификацию и количественное определение состава сложных смесей. Благодаря сочетанию высокоэффективных разделительных систем с чувствительными, селективными и специфическими детекторами, такими, например, как диодноматричный детектор (ДМД) в видимой и УФ-областях спектра, масс-спектрометрия и ИК-фурье-спектроскопия (ИКФС) удается надежно идентифицировать отдельные вещества. Приборное оформление этих методов настолько хорошо развито, что почти всегда удается автоматизировать проведение хроматографических анализов.

Области применения методов ГХ и ВЭЖХ ограничиваются требованиями, предъявляемыми к пробам в каждом из этих аналитических методов. Поэтому ВЭЖХ в настоящее время является наиболее широко распространенным методом разделения с хорошими перспективами на дальнейшее расширение области его применения. (Темпы прироста рынка приборов для ВЭЖХ стабильно превышают 10 % в год). Проблемы при применении ВЭЖХ возникают тогда, когда необходимо быстро и с большой эффективностью проанализировать полярные и ионогенные пробы, особенно пробы, обладающие высокой основностью, а также биополимеры. Это — одна из наиболее сложных проблем хроматографии, связанная с использованием стационарных фаз на основе силикагеля. Хотя в последние годы появились фазы, при использовании которых удается решить эти проблемы, для дальнейшего развития аналитических методов разделения ионогеннных веществ необходимо высокое мастерство и глубокое понимание протекающих при этом многообразных сорбционных ионообменных процессов. Фазы на основе чистых органических веществ из-за своей способности к набуханию обладают меньшей эффективностью и ограниченной устойчивостью к давлению по сравнению со стационарными фазами на основе силикагеля. Поэтому неудивительно, что эти фазы до настоящего времени не получили широкого распространения. Хотя в распоряжении исследователей имеются ионообменные фазы как на основе силикагеля, так и на основе полимеров, ионнообменная хроматография также не получила широкого распространения, так как для разделения компонентов необходима градиентная техника (градиенты pH или ионной силы). Для ионогенных соединений предлагается элекрофоретическая техника разделения.

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами: (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени; (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков.

В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью).

Классический электрофорез (гель-электрофорез или электрофорез на бумаге) имеет две характерные особенности. Во первых, количественный анализ возможен только с помощью измерений в отраженном свете, а в случае белков только по степени их окрашивания, и поэтому часто бывает ошибочным. Во-вторых, падение напряжения при прохождении через гель не может быть выбрано слишком высоким. Степень нагрева возрастает пропорционально напряжению, так что необходимо эффективное охлаждение, чтобы избежать высыхания геля. Время анализа на отрезке геля длиной в 10 см может достигать нескольких часов. В любом случае при гель-электрофорезе возможно проводить одновременно большое число разделений на одном геле, при этом производительность сильно увеличивается. В плоскостном варианте метода, кроме того, можно без затруднений проводить двумерные 20-процессы с использованием различных механизмов разделения. Отметим также высокую разрешающую способность 20-гель-электрофореза при анализе белков.

2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ)

Развитие КЭ началось с пионерских работ Миккерса и Эвериртса (конец 70-х годов) и Йортенсона и Лукаса (начало 80-х годов). Быстрое развитие метода было обусловлено двумя решающими усовершенствованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутренний диаметр разделительного капилляра; во-вторых, детектирование по электропроводности, пришедшее первоначально из изотахофореза, было заменено на прямое УФ-двтектирование в потоке жидкости. Предпосылкой для дальнейшего развития метода была возможность использования кварцевого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-области и с равномерным внутренним диаметром от 50 до 100 мкм. При этом улучшились как разделение, так и возможности детектирования.

С помощью кварцевого капилляра с внутренним диаметром 50-100 мкм удалось достигнуть высокоэффективного разделения белков и дансил-аминокислот, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему было сильно уменьшено влияние мешающей разделению термически индуцированной конвекции. Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре. Простота аппаратуры и возросшая потребность в разделении биомолекул привели во второй половине 80-х годов к повышенному интересу к данному методу.

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ.