Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3
Шрифт:
Исходя из этого, в качестве характеристики покрытия капилляров используется изменение ЭОП, вызванное покрытием. Вследствие того, что в большинстве случаев покрытия делаются для подавления взаимодействия белок-стенка, естественно, что в качестве меры качества модифицирования поверхности может служить разделение стандартных смесей белков.
Характеристики неполярных или гидрофобных покрытий можно получить с помощью газохроматографических измерений. Для определения толщины пленки исследуются времена удерживания н-нонана как стандартного вещества. Для характеристики оставшихся силанольных групп служат времена удерживания различных
9.3. Обзор важнейших химических покрытий
9.3.1. Общепринятые покрытия
9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия
Изготовление. Применение и реакционная способность моно-, ди- и трифункциональных алкилсиланов уже давно известны в ГХ и ВЭЖХ, поэтому здесь подробно на этом останавливаться не будем. Получаемая в результате поверхность имеет более или менее гидрофобный характер ("обращенная фаза"), в зависимости от длин цепочек нанесенных алифатаческих остатков. Благодаря слабой реакционной способности алкокси-силанов их можно наносить из водных растворов.
Электроосмос. При добавлении поверхностных силанольных групп с нейтральными (незаряженными) алкилсиланами ЭОП уменьшается. На рис. 61 представлены зависимости электроосмоса от значения pH буфера для кварцевого капилляра, покрытого С8 и 018, по сравнению с исходным капилляром. Видно, что поток уменьшается примерно на 40 % от исходного значения, и в этом случае трудно определить точку перелома. Меньший поток в 08-капилляре вероятно объясняется лучшим покрытием поверхности, т. к. "щетка" С8 предъявляет меньше стерических требований, чем С18.
Рис. 61. ЭОП/рН-характеристики различных покрытий (типов "щетки")
Стабильность. Из применения в хроматографии известно, что алкилсилановые покрытия стабильны по отношению к гидролизу только при pH 7. На рис. 62 показано изменение времени миграции некоего нейтрального маркера в течение 80 опытов при pH 7 для названных выше капилляров. Модифицированные капилляры показывают явный спад времени движения в течение первых 20 опытов. Возможные объяснения этого заключаются либо в потере несвязанного материала, либо в частичном гидролизе алкильной "щетки" на поверхности. После этого состояние капилляра, покрытого по крайней мере С8, стабилизируется.
Рис. 62. Стабильность покрытий (типы "щетки"), литература Supelco.
Применимость. В капиллярах с покрытиями С8 и С18 может быть проведено разделение белков. Однако покрытия алкилсиланами имеют два больших недостатка: с одной стороны — гидрофобный характер алкильной "щетки", с другой стороны — неполное экранирование поверхностных силамольмых групп, которые все еще взаимодействуют с белками.
9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия
Изготовление. Синтез проводится по описанным стандартным методам с применением
Электроосмос. Особенность арилпентафторидного (АПФ) покрытия заключается в том, что, в отличие от многих других покрытий, при нейтральном pH и средних ионных силах появляется отчетливый ЭОП (0.5 мм/с).
Применимость. Как показывают специальные хроматографические опыты, АПФ-покрытия также относятся к гидрофобным. Поэтому АПФ-капилляры можно с успехом использовать при pH 7 для разделения белков. Для тестовых смесей с белками, которые перекрывали область pH от 6.9 до 11, получали эффективность в многие сотни тысяч теоретических тарелок на метр (рис. 63). Благодаря вкладу электроосмоса в условиях проводимого анализа можно разделять как катионные, так и анионные белки за один проход.
Рис. 63. Структура АПФ-покрытия.
Пример разделения белков (А) с помощью покрытия АПФ; (В) — в капилляре из плавленного кварца; буфер — 200 мМ КС], pH 1; пробы: L — лизоцим, D — ДМСО, R — РНК крупного рогатого скота, Т — трипсиноген, WM — миоглобин кита, НМ — миоглобин лошади, НСА-В — карбоксиангидраза В человека, ВСА-В — карбоксиангидраза крупного рогатого скота.
9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия
Изготовление. В ЖХ для разделения белков в основном используются гидрофильные фазы, например, с диол-полиэтиленгликолем (ДПЭГ) или полисахаридами. Кварцевые капилляры также можно модифицировать этими функциональными группами.
В данном случае для синтеза используются двухступенчатые реакции, на первой стадии которых применяют, например, глицидсилан. Он может впоследствии либо гидролизоваться диолом, либо соединиться с глицерином или полиэтиленгликолем (рис. 64). Нанесение углеводородов происходит на первой стадии с помощью аминофункци-ональных групп, с которыми впоследствии можно связать мальтозу с использованием, например, циано-боргидридного катализа.
Рис. 64. Схема синтеза ПЭГ-покрытия.
Электроосмос и стабильность. При покрытии диолом и полиэтиленгликолем (ПЭГ), как и ожидалось, электроосмос резко уменьшается. (В случае диола mэоп=0.1 см2/кВс для 50 мМ фосфата и pH 6). Рабочая область для таких капилляров ограничивается значениями pH от 3 до 5. Долговременная стабильность в этих условиях достигает нескольких месяцев. При покрытии мальтозой возможна работа в области pH от 3 до 7. Вследствие того, что при нанесении аминосиланов с мальтозой реакции обмена подвергаются не все функциональные аминогруппы, при низких значениях pH поверхность заряжается положительно.