Охота на рыжего дьявола. Роман с микробиологами

Шраер-Петров Давид

ГЛАВА 30

Стафилококки против меланомы

Снова судьба свела меня со стафилококками. С конца 1980-х все чаще и чаще стали появляться научные статьи о том, что токсины некоторых микроорганизмов, особенно таких, которые вызывают токсические инфекции (холера, дифтерия, стафилококк), могут оказаться полезными в борьбе с различными видами рака. Эти токсины были названы суперантигенами, по их способности резко стимулировать иммунные реакции организма. Сущность и смысл этого феномена заключается в том, что раковые клетки сами по себе не способны вызвать заметную стимуляцию клеточного (лимфоциты) и гуморального (антитела) иммунитета. Нужен дополнительный стимулятор иммунитета — суперантиген. Одним из обобщающих обзоров этого направления в экспериментальной онкологии явилась статья Б. Торрес и соавторов (2001), так и названная «Суперантигены: хорошие, плохие и ужасные». В этот обзор как пример «хорошего» антигена вошла и моя с соавторами статья о применении стафилококкового энтеротоксина в комбинации с антимеланомной вакциной: David Р. Shrayer, Nicolas Kouttab, Vincent J. Hearing, Harold J. Wanebo «Immunization of mice with melanoma cells transfected to secrete the superantigen, staphylococcal enterotoxin A». Cancer Immunol. Immunother. v. 46: 7–13, 1998. Вообще-то идея применения микроорганизмов, наделенных токсинами, принадлежит ученику И. И. Мечникова (1845–1916) — А. М. Безредке (1870–1940),

который вслед за своим учителем стал вторым в истории русским директором института Пастера в Париже. Он описал значительное число случаев рака, оборванного присоединившейся инфекцией, например, малярией. Антираковой активностью, по мнению А. М. Безредки, обладали стрептококки, которые по морфологическим и биохимическим признакам (токсинам) близки стафилококкам. Особенное внимание исследователей привлек стафилококковый энтеротоксин А, который образуется клетками Staphylococcus aureus (золотистого стафилококка). С энтеротоксином А связаны тяжелейшие случаи пищевых токсикоинфекций. Об одном из них, наблюдавшимся мной во время командировки на БАМ, рассказано в главе «Охота на Рыжего Дьявола». И вот, оказалось, что малые дозы энтеротоксина А приводили к торможению развития различных экспериментальных опухолей: нефромы, карциномы, лимфомы и даже — меланомы. Конечно же, меня охватило нетерпение заставить «Рыжего Дьявола» противостоять меланоме. Я начал с традиционной схемы, комбинируя подкожное введение вакцины ФЕКА и относительно малых доз стафилококкового энтеротоксина А (0.25–1.00 микрограмм/инъекцию). После четырехнедельного курса преиммунизации мышей энтеротоксином им прививали клетки меланомы. И — наблюдали за ростом первичных опухолей, развитием метастазов, выживаемостью животных. Результаты были вполне обнадеживающими: стафилококковый энтеротоксин А повышал способность антимеланомной вакцины предупреждать рост злокачественных опухолей.

Вполне понятно, что было бы куда удобней и, по-видимому, эффективней передать от стафилококка гены, контролирующие продукцию энтеротоксина А, на клетки меланомы. А потом — облучить эти клетки, оставив им способность выживать некоторое время и выделять суперантиген (энтеротоксин А). Обсудив проблему с доктором Ванебо, мы предположили, что такая генетически сконструированная вакцина будет стимулировать Т-лимфоциты, клетки-киллеры, вызывать секрецию лимфокина IL-2 и способствовать продукции специфических антител к меланомным белкам. Я снова обратился к доктору Р. Муллигану (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). В его институте не занимались молекулярной генетикой стафилококков, но он назвал мне имя доктора Маршу Бетли, микробиолога из университета Висконсина — Мэдисона, которая работала в этой области молекулярной генетики. Доктор Бетли сконструировала плазмиду pSVneo-sea, содержащую нужный ген, прислала мне ее скорой почтой, а я выполнил трансфекцию клеток меланомы. Оставалось испытать новую вакцину в экспериментах на животных.

Я был приглашен представить данные этих экспериментов на 3-й совместной конференции Американской ассоциации по исследованию рака и Японской раковой ассоциации на острове Мауи (Гавайи). В жизни я не встречал такой красоты! Пожалуй, нечто похожее видел в Сибири. Мы подлетали к Гавайским островам. Клубились кратеры вулканов. Киты плескались в океане. На берегу между океаном и гигантским отелем/курортом Мариотт раскачивались гигантские сосны и пальмы. Конференция продолжалась семь дней. С утра были доклады и их обсуждение. Преобладали сообщения об изучении молекулярной генетики злокачественных опухолей. Царил всеобщий энтузиазм и решимость нащупать наконец-то ген, виновный в раковом (роковом!) перерождении нормальных клеток человека и животных. Или — найти такие гены, которые смогут противостоять развитию злокачественных опухолей. Некоторые сообщения, в том числе наше, были посвящены поискам генетически модифицированных противораковых вакцин. Совершенно замечательным был доклад сопредседателя конференции выдающегося японского онколога профессора Масааки Терада. Это было философское обобщение наблюдений клинициста и патолога, собранных за много десятков лет. Звучал ли пессимизм в его словах? Если и звучал, то пессимизм реалистический. Профессор Терада высказал мысль, что в организме каждого человека заложены раковые клетки или их предшественники. (Современные данные о стволовых клетках — stem cells — подтверждают это обобщение.) До поры до времени эти клетки находятся в латентном (дремлющем) состоянии. В процессе патологоанатомических исследований у людей, умерших вовсе не от рака, нередко находят такие латентные опухоли. То есть, хотя рак неизбежен, дело онкологов продлить жизнь больного, придерживая раковые клетки в латентной фазе. Рано утром мы успевали с Милой искупаться в океане, лениво накатывавшем двухметровые волны. Наши коллеги — американцы неодобрительно смотрели на авантюрные купания «of these strange Russians». Сами они предпочитали великолепный и безопасный бассейн с джакузи, который бурлил, как гейзер. Завтракали участники конференции под соснами/пальмами на берегу Тихого океана. Японская сторона, финансировавшая конференцию, развлекала нас, как могла. В барах, примыкавших к залу заседаний или помещениях для демонстрации постеров, весь день предлагалось кофе, прохладительные напитки и вино. По вечерам устраивались обеды с представлениями, на которых гавайские артисты и музыканты демонстрировали национальные танцы и музыку. Гавайцы показались мне красивым жизнерадостным народом, в котором мягко сочетались азиатские и полинезийские черты. Может быть, азиатские (монголоидные) и тамильские (индо-европейские)? Известно, что древние тамилы были отважными мореплавателями. Кто знает, не заплыли ли они из Индии на Гавайи? По вечерам мы катались по острову в раскрашенном открытом автобусе или прогуливались по аллее, тянувшейся вдоль многочисленных роскошных отелей, которые соревновались по части архитектуры с Лас Вегасом. Розовые фламинго пританцовывали в стиле классического кордебалета.

Однако провести успешную трансфекцию меланомных клеток sea — геном и выделить единичные трансфектанты из многомиллионной толпы исходной клеточной популяции было только началом. Снова предстояло утверждать протокол для выполнения опытов по иммунизации лабораторных мышей клетками меланомы, продуцирующими суперантиген. Впоследствии к этой лечебной схеме был присоединен интерлейкин-2 (IL-2), который усиливал неспецифический иммуностимулирующий эффект энтеротоксина А. Пожалуй, это была последняя из сконструированных меланомных вакцин, которую я комбинировал с интерлейкином-2.

В природе бывают совпадения. Хорошие и плохие. Известен закон парных случаев в медицине: привозят по скорой помощи тяжелого больного — жди вскоре пациента с похожим диагнозом. Весной 1999 года я прилетел в Сан-Франциско доложить о результатах комбинации вакцины, продуцирующей суперантиген, с лимфокином IL-2. И тотчас на одном из заседаний носом к носу столкнулся с доктором Полем Калабризи, бывшим директором Ракового центра при РВГ. Со времени его внезапного ухода и начала работы в Род-Айлэндском госпитале прошло много лет. И вдруг встреча. И какая теплая! Доктор Калабризи чрезвычайно заинтересовался данными, представленными мной. «Звоните, Давид, в любое время! У нас есть общие интересы в лечении экспериментальной меланомы».

По возвращении в Провиденс я оказался в круговороте поистине тяжелых совпадений. Однажды утром мне позвонили из бостонского госпиталя: мой сын Максим попал в отделение скорой помощи. Я разговаривал с Милой по телефону о времени выезда в Бостон, когда в мой кабинет вошел доктор Ванебо и, смущаясь и недоговаривая всего до конца, как это бывает с ним, когда он в чем-то неуверен, сказал, что деньги на мою научную работу кончаются. А на следующий день мне позвонила из университета Висконсина-Мадисона Мари Тримэйн и сказала, что профессор Марша Бэтли, которая сконструировала плазмиду pSVneo — sea, умирает от метастаза меланомы в головной мозг. Я пришел в себя после трех тяжелых совпадений только через месяц. Я вернусь к этому. А пока расскажу еще об одной серии экспериментов, направленных на предотвращение меланомы.

ГЛАВА 31

Живая вакцина в капсулах

Среди научных сотрудников профессора Х. Х. Планельеса в Институте имени Гамалея в Москве, где я начал работать в конце 1960-х, была весьма пожилая исследовательница, которая время от времени поражала нас, молодых и порой неуважительных, микробиологов своими абсолютно оригинальными по методике и замыслу экспериментами. На всю жизнь я запомнил такой ее опыт на белых мышах, целью которого было получить антитела к брюшнотифозным палочкам. Она свято верила, что живые аттенуированные вакцины (скажем, BCG, состоящая из живых ослабленных туберкулезных палочек) таят в себе возможность реверсии (обратной мутации) к исходному вирулентному микроорганизму. Теоретически это было правдой. Чрезвычайно редко, но все же происходит это с туберкулезной вакциной, вакциной против полиомиэлита, оспы и другими, если вакцинируются иммунодефицитные больные (СПИД, лейкемия, кахексия). Нина Петровна (кажется, я не ошибаюсь в имени) была категорически против живых вакцин. Вакцины из убитых микробных клеток или изолированных микробных антигенов ее тоже не устраивали, потому что теряли богатый набор химических веществ, содержащихся в целостном микроорганизме. Значит, надо было иммунизировать мышей или кроликов (а в перспективе — людей) живыми неизмененными клетками бактерий, которые будут заключены в некий полупроницаемый скафандр. Внутрь скафандра (искусственной капсулы) могут проникать питательные вещества из организма, а наружу выходить продукты микробного метаболизма и антигены. Сами же микробы не должны проходить через стенки скафандра и поэтому заражать организм. Нина Петровна брала стерильные стеклянные ампулы, в которых обычно лиофилизировали микроорганизмы для длительного хранения. В стенках ампул при помощи раскаленной иглы проделывались дырочки. Ампула заполнялась питательным агаром (среда для выращивания микробов), который мгновенно застывал, заполняя дырочки. Внутрь агара, заключенного в ампуле, вносилась культура брюшнотифозной палочки, и горлышко ампулы запаивалось. Ампулу стерильно имплантировали внутрь брюшной полости животного. Рана заживала. Через две недели в крови подопытного животного появлялись антитела к брюшнотифозным антигенам: О, Н и Vi. Но опыт не удалось успешно завершить. Последовала катастрофа: брюшнотифозные палочки прорастали сквозь агар, проникали через дырочки в стенке ампулы, попадали в брюшную полость и заражали подопытных животных, которые вскоре погибали. Блестяще задуманный эксперимент проваливался из-за того, что у Нины Петровны не было ампул, сделанных из миллипоровых фильтров с отверстиями в 0.2р, задерживающих бактерии.

Обо всем этом я вспомнил, размышляя над возможностью вакцинировать мышей против меланомы — живыми полноценными клетками, а не облученными, выживающими в организме не более двух недель. Мне повезло. В лаборатории искусственных органов Браунского университета в те времена (середина 1990-х) д-ром М. Годдардом и его сотрудниками были выполнены успешные экспериментальные исследования по вживлению инкапсулированных трансплантантов животных клеток для использования их при лечении болезни Паркинсона, диабета и хронической боли. Я позвонил д-ру Годдарду. Мы встретились. Он пригласил меня рассказать сотрудникам его лаборатории о модели экспериментальной меланомы и антимеланомных вакцинах. Моя идея о сотрудничестве была поддержана д-ром Ванебо. С нашей лабораторией сотрудничала аспирантка д-ра Годдарда — Бет Зелински.

Бет Зелински была миловидной миниатюрной женщиной, чрезвычайно увлеченной экспериментальной работой. Бет готовила полимерные стерилизующиеся сегменты (трубочки-капсулы), в стенке которых были микроскопических поры, через которые легко проникала снаружи питательная среда, а изнутри сочились продукты метаболизма меланомных клеток, в том числе антигены. Сами клетки меланомы были гораздо крупней микроскопических пор и оставались внутри трубочек-капсул. Сначала запаивался один конец капсулы, которая заполнялась взвесью раковых клеток в питательной среде. Потом запаивался другой конец трубочки. Первые серии экспериментов состояли в том, чтобы узнать, растут ли клетки меланомы внутри капсул, помещенных в пластиковые сосуды, наполненные питательной средой. Через неделю капсулы изымались из питательной среды, фиксировались в растворе формалина и исследовались гистологически. К нашей радости оказалось, что клетки злокачественной опухоли прекрасно развивались внутри капсулы с микроскопическими порами, помещенной в питательную среду.

Можно было переходить к экспериментам на лабораторных животных. Мышам под общим наркозом разрезали живот по средней линии и внутрь брюшной полости вносили полимерные капсулы, содержащие живые клетки меланомы (живую антимеланомную вакцину). Альтернативной локализацией был продольный разрез в межлопаточной области, куда вносились полимерные пористые капсулы, содержащие клетки меланомы. Раны закрывались при помощи стерильных металлических клипс, которые через неделю удалялись. В конце эксперимента, во время аутопсии капсулы удалялись и исследовались гистологически, чтобы подтвердить присутствие жизнеспособных клеток меланомы. Кроме того, исследовалось пространство вокруг капсул, чтобы убедиться в том, что клетки меланомы не проникли внутрь организма подопытной мыши. В качестве контроля служили капсулы, содержащие питательную среду без клеток меланомы. Начиная с 3-й недели после инкапсулирования в крови животных, которым были вшиты капсулы с меланомными клетками, начали обнаруживаться антитела, направленные против белков этой злокачественной опухоли. Теперь важно было узнать: предупреждает ли иммунизация нашей капсульной вакциной развитие ракового процесса у мышей? Через 4 недели после введения капсул мышей заражали клетками меланомы. К нашему удовлетворению, у мышей, которым вводили инкапсулированные клетки меланомы, раковый процесс развивался гораздо медленнее, чем в контроле — у животных, которым вводили «пустые» капсулы. Данные были статистически обработаны, написана статья, приготовлены графики и фотографии животных с крупными черными меланомными опухолями на хвостах контрольных мышей и едва заметными очагами меланомы у иммунизированных животных. Статья была роздана соавторам, и началось ее редактирование. Далее произошло нечто, необъяснимое для меня и по сей день. Возникли разговоры о возможном патентовании вместо публикации в открытой печати. Часть авторов была против патентования: это отодвинуло бы для Бет Зелински защиту диссертации на длительный срок. Потом Бет стала молодой мамой, а потом вовсе исчезла из Браунского университета. Я пытался узнать что-нибудь определенное у д-ра Годдарда, но не получилось. Постепенно этот фантастически интересный проект ушел в песок забвения.