Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3
Шрифт:
При переносе ИЭФ на узкие капилляры применение стабилизирующих гелей не является безусловно необходимым. Правда, ЭОП необходимо полностью подавить для того, чтобы сделать возможным образование градиента pH, иначе ЭОП быстро вынесет раствор амфолита из капилляра и сделает невозможным проведение фокусировки. Управлять ЭОП можно, как уже отмечалось в одной из глав, модифицируя поверхность капилляра. Понижать ЭОП для проведения фокусировки можно также, добавляя высоковязкие полимеры, например, метилцеллюлозу, для повышения вязкости буферного раствора. Преимущество последнего способа заключается в том, что зачастую для ИЭФ необходимо применять очень высокие значения pH, а ковалентное покрытие капилляра не может долго выдерживать сильнощелочные значения pH.
В отличие от ИЭФ на плоской подложке в капилляре образование градиента pH и фокусировка
При этом проводящееся титрование разрушает градиент pH, отчего белки расфокусировываются, и оказывается возможным транспорт белков к детектору. Другая возможность мобилизации белков состоит в том, что в капилляре они приводятся в движение по направлению к детектору путем наложения разности давлений (давление или разрежение). При этом, однако, напряжение должно оставаться включенным, чтобы противодействовать уширению полос в процессе детектирования. Поскольку фокусировка происходит во всем капилляре, т. е. в том числе и между ячейкой детектора и катодом, белки с крайне высокими значениями р1 могут уклоняться от детектирования. Этого можно избежать, заполняя капилляр едким натром вплоть до места детектирования.
В качестве примера возможности ИЭФ в капиллярах представлены на рис. 105. Модифицирование стенок капилляра динамическим или ковалентным способом допустимо также и в случае ИЭФ, поскольку здесь, как и в необработанном капилляре, белки сильно адсорбируются на стенках капилляра.
Рис. 105. Разделение 7 белков вследствие различия их изоэлектрических точек.
14. Изотахофорез (ИТФ)
Если описанные до сих пор электрофоретические способы разделения в капиллярах соответствовали элюентной хроматографии (прерывистый ввод проб, постоянный состав элюента, различные скорости движения компонентов пробы), то метод ИТФ соответствует вы-теснительной хроматографии. В обоих случаях все компоненты пробы движутся с одинаковой скоростью. ИТФ описан много лет назад и проводился тогда в основном в тефлоновых трубках. Однако из-за проблем выбора конкретных электролитов и ограничений в выборе детекторов (применимы только детекторы по электропроводности) этот метод было невозможно использовать в качестве точного аналитического метода. В случае ИТФ проба вводится между двумя электролитами с различными подвижностями ионов, выбранными так, чтобы они ограничивали подвижности компонентов пробы. Обычно ведущий электролит обладает наивысшей, а конечный электролит — наиболее низкой подвижностью из всех движущихся ионов. После достижения стационарного состояния все одинаково заряженные ионы движутся с одинаковыми скоростями. На рис. 106 это показано схематически. В каждой зоне при ИТФ имеется своя напряженность поля. Внутри каждой зоны напряженность поля постоянна, изменения происходят скачком на границах зон.
Рис. 106. Схема ИТФ.
По этой причине методом ИТФ разделяли только анионы или катионы. Концентрационный ход в зонах описывается прямоугольной функцией: зоны следуют, как в вытеснительной хроматографии, непосредственно одна за другой. Применяя детектор по электропроводности, получают ступенчатый сигнал.
ИТФ преимущественно применяют для разделения неорганических ионов и органических карбоновых кислот. Из-за проблем детектирования и трудностей, связанных с нахождением подходящих
Стадия обогащения (концентрирования) может проводиться непосредственно в разделительном капилляре КЭ. В капилляр, заполненный разделяющим электролитом, вводится короткая зона несущего элетролита, вслед за которой вводится проба. При этом могут дозироваться объемы пробы порядка микролитров. Обогащение проходит в направлении несущего электролита, при этом возможно концентрирование в 100 раз. В случав белков схожий эффект дает добавка «ацетата аммония к раствору пробы. Ион ацетата в данном случае действует как несущий электролит. Описано также сочетание двух аппаратов с двумя УФ-детекторами, ИТФ для концентрирования и КЭ для разделения. Когда сконцентрированная ИТФ-зона достигает первого детектора, система разделения КЭ переключается.
15. Электрохроматография (ЭХ)
Основной вклад в уширение полос в ВЭЖХ дают параболический профиль скоростей и диффузия в порах стационарной фазы. Одной из возможностей уменьшения этого вклада в уширение полос является уменьшение диаметра частиц, однако при этом возрастает перепад давления. В идеальном случае ЭОП в наполненном капилляре не зависит от размера частиц наполнителя. Кроме того, поршнеобразная форма профиля скоростей ЭОП способствует высокой разделительной способности. Поэтому пытаются соединить высокую селективность заполненной разделительной колонки ВЭЖХ с "остротой" разделения, свойственной КЭ. В данном случае основополагающие принципы разделения и стационарные фазы те же, что в ВЭЖХ, однако транспорт элюентов (водно-органических буферных растворов) и компонентов пробы обеспечивается миграцией под действием электрического поля. Для уменьшения вклада сорбционных процессов в уширение полос применяют очень маленькие непористые частицы (1 мкм). Следует отметить, что до настоящего времени в литературе нет реальных примеров применения, а есть только теоретические работы. Многообещающие теоретические предсказания до сих пор не подтверждены экспериментально. Получаемые малые ВЭТТ лишь незначительно отличаются от полученных в ВЭЖХ. Одной из причин этого может быть проблема детектирования. В КЭ детектируют с помощью разделяющего капилляра, в наполненной колонке это уже невозможно. Таким образом, дополнительно возникают известные в микро-ВЭЖХ проблемы, связанные с подключением детектора к разделяющему капилляру.
Рис. 107. Разделение с помощью ЭХ в капилляре, наполненном обращенной фазой. Последовательность элюирования: тио-мочевина, бензиловый спирт, бензальдегид, бензол, 1,2-дихлорбекзод, 1,2,3-трихлорбензол, 1,2,3,4-тетрахлорбензод, пентахлорбензол, гексахлорбензол.
Условия разделения: длина капилляра 28.5 см, 50 мкм, наполнитель — Hypersil ODS (3 мкм), ввод пробы: 2.5 кВ в течение 5 с, наложенное поле 45 кВ (2 мкА), детектирование при 220 нм, подвижная фаза — 2 мМ динатрийтетраборат, 80 % апетонитрил, pH 8.7.
16. Перспективы
В таблице 31 представлены описанные разделительные системы, применение которых основано на миграции, обусловленной электрическим полем. Наиболее часто применяемой системой является, конечно, КЭ в кварцевых капиллярах (открытых трубках) с незаполненными или поверхностно-модифицированными стенками капилляра. Нейтральные молекулы также могут быть разделены в этих системах с помощью добавок мицеллообразователей.