Охота на рыжего дьявола. Роман с микробиологами

Шраер-Петров Давид

Из окна такси был виден ночной Тбилиси 1959 года. Проспект Руставели с погашенными фонарями. Кучки гуляк толпились около затихающих ресторанчиков. Путешественник расплатился с таксистом, и его окружила кучка парней в кожаных куртках. Он даже усмехнулся: «Что вам нужно? Кто вы такие? Кто вы такие?» «Сейчас начнем знакомиться, дорогой. Все станет ясно, как день. Но сначала ты должен понять закон кавказского гостеприимства», — сказал один из них. «Хорош закон, если вы окружили меня впятером и не пускаете в гостиницу. Разве так мы принимаем вас в России?» «Если бы русские не боялись нас и не хотели наших денег, то принимали бы еще хуже. Знаем мы ваше хваленое гостеприимство!» — сказал другой. На это путешественник, порывшись во внутреннем кармане пиджака и вытащив грузинско-русский разговорник, прочитал сначала по-русски, а потом по-грузински в русской транскрипции: «Если любишь в гости ходить, надо любить и гостей принимать. Ты стумба гикварс, маспиндзлобац учда гиквардецо». На что еще один из командос ответил: «Стумари Хвтисаа! Гость от Бога!» «Вот видите, я ваш гость. Что же вы не даете пройти в гостиницу?» — засмеялся путешественник. «Он смеется. Ему весело», — прошелестело вокруг. И один из командос в кожаной куртке, распираемой бычьими мясами шеи, бицепсов и спины, оскалясь золотыми фиксами зубов, захохотал: «Стумари тавшекавебулиа карги, масциндзели ку гулухвио. Гость хорош сдержанный, а хозяин щедрый.

Меня зовут Зураб. Запомнил? Зураб!» — сказал первый и ударил путешественника под ложечку. Тот согнулся от боли и от сбитого дыхания. Руки его были стиснуты руками командос, «Слушай сюда, дорогой гость. Меня называют Рафаил», — сказал второй и ударил путешественника в подбородок. Волна голубых искр, боль от прикушенного языка, желтые молнии, гром, темнота и соленая влага, заполнившая рот, ошарашили путешественника. Когда он опомнился и начал сплевывать кровь изо рта, третий сказал: «Ну, дорогой гость, вкусил кавказского гостеприимства?» Путешественник молчал. Тогда третий продолжил: «Меня зовут Дато. Но когда ты окончательно познакомишься с Кареном (он показал на четвертого) и с Гиви (на пятого), будет поздно толковать. Ты будешь пребывать в глубоком нокауте. Понял?» «О чем вы хотите толковать?» — прохрипел путешественник. «Забудь историю с французским коттеджем! Самое позднее завтра утром твоего духа не должно быть в Грузии. Заказывай, куда тебя переправить?» «В Ленинград, — ответил путешественник. — Купите билет до Ленинграда. Деньги в бумажнике».

ГЛАВА 14

Волшебные пули или почтовые вагоны?

Еще Феликс д’Эрелль заметил, что бактериофаги могут не только растворять (лизировать) микробные культуры, но и приводить их к наследуемым изменениям. В те начальные годы молекулярной биологии ученые еще не знали о способности микробных вирусов переносить гены от одной бактериальной клетки на другую. Это явление перенесения микробными вирусами от одной бактерии на другую генетического материала, в частности, участков ДНК, контролирующих лекарственную устойчивость, открытое в 1952 году американцами Н. Циндером и Дж. Ледербергом (N. D. Zinder, J. Lederberg) на модели кишечной палочки (E. coli), получило название фаговой трансдукции. Подобно трансформации у бактерий, которая происходит при помощи свободной ДНК, трансдукция представляет собой внедрение бактериофага внутрь бактериальной клетки (реципиента) и перенесение части генетического материала, присутствующего в хромосоме или эписоме клетки-донора, на котором бактериофаг до этого размножался. Чаще всего трансдукция применяется для изучения генетических рекомбинаций. Меня больше всего интересовал феномен котрансдукции — т. е. возможности одновременного переноса от микроба-донора микробу-реципиенту не только генов лекарственной устойчивости (пенициллиназные плазмиды), но и одновременно — генов, контролирующих патогенность микроорганизмов — способность вызывать заболевания. Из клинико-бактериологических наблюдений следовало, что у золотистого стафилококка, да и у других клинически активных бактерий (особенно возбудителей внутрибольничных инфекций) устойчивость к антибиотикам всегда сопровождается способностью микроорганизмов вызывать тяжелые патологические процессы. Конечно же, распространение болезнетворных микроорганизмов происходит в соответствии с классическими законами эпидемиологии: источник инфекции — пути распространения микроорганизмов — восприимчивые люди или животные. Но, оказывается, были и другие эпидемиологические пути, когда для поддержания высокого уровня устойчивости к антибиотикам достаточен обмен генами между бактериями. Этот обмен, в частности у стафилококков, мог осуществляться при помощи бактериофагов. Конечно же, после подтверждения такой возможности в опытах in vitro я предполагал перейти к экспериментам на лабораторных животных. Ну и как конечная цель — мечталось найти такие препараты, которые будут предотвращать трансдукцию пени-циллиназных плазмид in vitro и in vivo.

Эксперименты эти были задуманы и начаты еще в Отделе Х. Х. Планельеса в 1969 году и продолжались в Отделе раневых инфекций с прерываниями на другие проекты, поездки и экспедиции вплоть до моего ухода из Института имени Гамалея в январе 1979 года. Общая схема экспериментов сводилась к тому, чтобы бактериофаг, предварительно размножившийся на пенициллиноустойчивой высокопатогенной культуре Staphylococcus aureus и «захвативший» часть донорской ДНК с пени-циллиназной плазмидой и генами, контролирующими способность вызывать патологические процессы, передавал эти свойства на пенициллиночувствительную культуру стафилококка-реципиента. Переносчик донорских генов — бактериофаг — отделялся от донорской культуры при помощи миллипоровых фильтров, на которых задерживались клетки донорской культуры. После контакта бактериофага (фагового лизата) с пенициллиночувствительной культурой стафилококка часть клеток-реципиентов приобретала пенициллиназные плазмиды и становилась пенициллиноустойчивой. Эти клетки росли на среде, содержащей пенициллин, и колонии их выделяли пенициллиназу. Реципиентные же клетки, не получившие пенициллиназную плазмиду, подвергались отрицательной селекции пенициллином — погибали. Эксперименты оказались гораздо сложнее, чем предварительная схема. Даже начиная с опытов in vitro. Достаточно сказать, что результаты успешной трансдукции зависели от количества фаговых частиц в лизате, полученном после размножения бактериофага на донорской культуре стафилококка. Чем больше фаговых частиц, тем больше вероятность переноса генов от донора к реципиенту. Но, одновременно, повышается число клеток-реципиентов, лизированных бактериофагом еще до того, как они стали трансдуктантами. Надо было придумать некий прием, который позволит разделить фаг, размножившийся на донорской культуре стафилококка, на две ветви: лизирующую и трансдуцирующую. Это представление о том, что в стоке бактериофага находятся одновременно два типа вирусных частиц, было, несомненно, навеяно идеями Л. А. Зильбера (1894–1966) о вирусогенетической теории возникновения злокачественных опухолей.

Я начал работать в Институте имени Гамалея с января 1967 года, к моему горькому сожалению не застав в живых Л. A. Зильбера, который основал Отдел вирусологии и иммунологии опухолей. Как и многие ведущие микробиологи нашего Института, Л. А. Зильбер в конце 1930-х — начале 1940-х прошел тюрьмы и лагеря ГУЛАГа. Об этом осторожно (а как было иначе в те годы?) рассказывается в романе В. А. Каверина (брата Л. А. Зильбера) «Открытая книга». Отдел Зильбера, который после его смерти возглавил Г. И. Абелев, был рассадником вольнодумия. Именно здесь работал «диссидент», голосовавший против осуждения Израиля. Некоторые сотрудники этого отдела подписали письмо в защиту А. И. Солженицына. По случайному совпадению я оказался соседом по дому И. С. Ирлина, одного из авторов (Зильбер, Л.А., Ирлин, И.С., Киселев, Ф.Л.) монографии «Эволюция вирусо-генетической теории возникновения опухолей», М. 1975. Бывало, мы возвращались домой и обсуждали возможности связи (подобия) между феноменом передачи онковирусами генетического материала, контролирующего превращение нормальных клеток в клетки раковые, и фаговой трансдукцией. Согласно Зильберу, обычные инфекционные вирусы

проникают в клетку, размножаются, клетка погибает и новая генерация вирусов освобождается, чтобы начать следующий цикл. Никакой раковой трансформации не происходит. При внедрении же онковирусов клетка не погибает, а перерождается. Становится раковой клеткой, исходной точкой злокачественной опухоли. Доказательством перерождения является присутствие в геноме раковой клетки «чужеродной, онковирусной ДНК», а среди белков клетки — «чужеродных раковых антигенов». Именно присутствие раковых антигенов навело Зильбера на мысль о вакцинах против рака.

Не происходит ли нечто подобное с микробными клетками и микробными вирусами? Литическая ветвь бактериофага проникает внутрь бактерии (в моих опытах — стафилококка), размножается, клетка погибает, новая генерация бактериофага выбрасывается наружу, как десант, чтобы начать новый литический цикл. Или бактериофаг погибает, если микробные клетки резистентны к его литическим ферментам. При трансдукции микробная клетка не погибает, а изменяется, включив в свой геном участки ДНК, переданные трансдуцирующей ветвью бактериофага. Наряду с идеями Л. А. Зильбера мощное влияние на меня оказали классические работы французского микробиолога Андре Львова (Andre Lwoff, 1902–1994), который получил Нобелевскую премию (1965) за открытие лизогении, феномена, когда бактериофаг инфицирует клетку бактерии и встраивается в бактериальную хромосому как линейный сегмент. При этом клетка не погибает, а микробный вирус, который теперь называется профагом, передается микроорганизмом из поколения в поколение. Нередко лизогенизация сопровождается передачей одного из микробных генов. Например, у дифтерийных палочек лизогенизация сопровождается передачей способности вырабатывать весьма опасный токсин, определяющий патогенез заболевания дифтерии.

Я предположил, что если поместить фаговый лизат в специальные пробирки и подвергнуть ультрацентрифугированию (вращению на огромной скорости в 30 тысяч и более оборотов в минуту), трансдуцирующие фаговые частицы, захватившие донорскую ДНК и поэтому отяжелевшие, окажутся на самом дне пробирки. Лизирующие же частицы, более легкие, будут плавать в надосадочной жидкости. Надо сказать, что в Институте была всего одна ультрацентрифуга, которая располагалась за «семью замками» в одном из лабораторных корпусов. Записываться на ультрацентрифугирование надо было чуть ли не за месяц вперед. Командовал ультрацентрифугой весьма надменный молодой человек, который сразу давал понять, что результаты будущих экспериментов отныне целиком в его руках. Мне повезло. Или я вел себя достаточно дипломатично, или день выпал везучий, но ультрацентрифугирование и последующее разделение литической и трансдуцирующей ветвей бактериофага прошло успешно, и мои донорские фаги работали. Мне удалось передать in vitro от донора к реципиенту способность не только расти на среде с пенициллином, продуцируя бета-лактамазу (пенициллиназу), но и выделять гемолизин — микробный токсин, разрушающий красные кровяные клетки. Пора было переходить к опытам на животных.

Подопытных белых мышей внутривенно заражали культурой стафилококка-реципиента, высокочувствительного к пенициллину и не способного растворять эритроциты. Через сутки этим животным внутрибрюшинно вводили донорский фаговый лизат. Еще через 24 часа начинали и в течение 10 дней продолжали внутримышечно вводить мышам пенициллин для селекции пенициллиноустойчивых трансдуктантов. После этого животных усыпляли, производили вскрытие и тщательно исследовали почки и другие органы. Надо было сравнить количество абсцессов у контрольных мышей и у животных, которым вводили трансдуцирующий бактериофаг. Кроме того, почки мышей асептически извлекали во время вскрытия, размельчали при помощи гомогенизатора, а измельченную почечную ткань высевали на чашки Петри с питательным агаром, содержащим пенициллин. Посевы ставили в термостат на сутки при 37 градусов Цельсия. Как правило, в контроле (без введения фага) роста стафилококков не было. При высеве из почек животных, которых заражали пенициллиночувствительными стафилококками и которым вводили донорский фаговый лизат, вырастали колонии стафилококков. Это значило, что в условиях экспериментальной стафилококковой инфекции в организме высших животных происходит трансдукция пенициллиназных плазмид от высокопатогенной культуры золотистого стафилококка к пенициллиночувствительной культуре стафилококка. И самое важное — происходит одновременная передача (котрансдукция) одного из признаков патогенности: способности вырабатывать гемолизин — токсин, разрушающий эритроциты. Мне удалось показать, что трансдукция пенициллиназных генов в условиях живого организма реальна и может сопровождаться котрансдукцией микробного токсина, что сближает ее с лизогенизацией у возбудителя дифтерии.

Эксперименты по трансдукции пенициллиназных плазмид в сотрудничестве с Г. Л. Ратгауз я продолжил в лаборатории стафилококковых инфекций. Важно было проверить свои выводы на культурах микроорганизмов, известных в мировой литературе. Я написал в США профессору Р. Новику (R. Novick), и он любезно прислал в наше распоряжение донорский и реципиентный международные штаммы золотистого стафилококка. Экспериментальное преимущество этой пары культур было в том, что стафилококк-донор был высокоустойчив к пенициллину, но чувствителен к стрептомицину. Наоборот, микроб-реципиент отличался высокой чувствительностью к пенициллину и резистентностью к стрептомицину. Так что истинные трансдуктанты должны были получить от «родительских» культур оба признака и вырасти на питательном агаре, содержащем оба антибиотика: пенициллин и стрептомицин. Опыты прошли успешно и подтвердили мои ранние эксперименты.

Очевидным было, что в дополнение к постулатам классической эпидемиологии существуют некие дополнительные законы, согласно которым микроорганизмы обмениваются генетической информацией. Да, микробные вирусы, в частности стафилококковые бактериофаги, были способны превращать практически безвредных обитателей кожи и слизистых оболочек в опасные болезнетворные микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам.

Вместе с В. А. Благовещенским в 1972 году удалось показать возможность межвидовой трансдукции пеницилиназных плазмид у относительно безвредных споровых микроорганизмов, близких по происхождению к возбудителям сибирской язвы. Это значило, что в руках маньяков невидимый и неопределяемый никакими существующими эпидемиологическими методами донорский бактериофаг, размноженный на бациллах сибирской язвы, может передать безвредным обитателям нормальной внешней среды способность вызывать страшную эпидемию.

Надо было искать способы прерывания трансдукции. В содружестве с Г. Л. Ратгауз мы взялись за приготовление антифаговых сывороток. Это было вполне естественным. Тем более, что в литературе были опубликованы данные о возможности получения иммунных сывороток, нейтрализующих бактериофаги. Мы «наработали» достаточное количество донорского фага и отправились в виварий. Была зима, январь или февраль. Стояла ясная погода после прошедшего ночью снегопада. Вдруг в природе стало тихо и прозрачно. Снег лежал на деревьях, окружавших главную аллею. Мы заговорили о нашем приятеле, бывшем сотруднике Института, который эмигрировал в Израиль. «Как он там? Как будто бы получил место научного сотрудника в Иерусалимском университете? Так ли это?» Никто из нас не говорил вслух, что примеривает свою жизнь и работу к возможным поворотам судьбы. Но, ручаюсь, оба думали об одном и том же.