Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

Панчин Александр

Маркировка «не содержит ГМО» в лучшем случае отражает отсутствие в геноме организма известных вставок ДНК, которые используются для генной инженерии, зарегистрированы и для которых разработаны протоколы обнаружения. А что, если есть другие, не зарегистрированные вставки? Дело в том, что запретительные и ограничительные меры по отношению к созданию, выращиванию, маркировке или торговле организмами, созданными методами генной инженерии, могут привести к развитию черного рынка биотехнологий. А то и уже привели.

Если организм был создан методами генной инженерии в тайне и при его создании были приняты меры предосторожности, то определить, что он является генетически модифицированным, будет довольно сложно. Существующие тесты для обнаружения ГМО основаны на том, что известен набор генов, которые использовались

генными инженерами при создании зарегистрированных ГМ сортов. Как правило, эти гены хорошо изучены и запатентованы, их последовательности известны ученым и контролирующим организациям. Наиболее простые тесты на ГМО сводятся к тому, что мы проверяем, есть ли в образце последовательности упомянутых генов. Если их нет, организм признается «не содержащим ГМО».

Продукт, созданный методами генной инженерии, пройдет этот тест, если при его создании использовались другие (незарегистрированные) гены или если переносимые гены были правильным образом изменены. Фактически он будет ГМО, но доказать это в суде будет очень трудно. Давайте рассмотрим один из способов изменить уже изученный ген таким образом, чтобы его присутствие было сложно обнаружить в ходе рутинной проверки.

Ранее мы обсуждали ген, кодирующий Cry-токсин, который производится бактерией Bacillus thuringiensis, — он делает растение устойчивым к вредителям. Как уже упоминалось, это одна из самых распространенных, изученных и экономически выгодных генетических модификаций. Ниже приведена нуклеотидная последовательность природного гена Cry-токсина в одном из бактериальных штаммов.

А вот аминокислотная последовательность белка, который кодирует этот ген.

Все последовательности находятся в свободном доступе, и любой специалист знает, где их найти. Обычный тест на наличие вставки в геноме организма заключается в поиске ее нуклеотидной последовательности в образце. Самый простой способ называется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Его часто представляют как точный и надежный подход для обнаружения трансгенных вставок [247] . Существуют и другие, но метод ПЦР в его различных вариациях — самый дешевый, широко используемый и признан большинством регулирующих организаций.

247

Holst-Jensen A. et al.: PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Anal Bioanal Chem 2003, 375(8):985–93.

ПЦР — один из важнейших многофункциональных инструментов в руках биотехнолога. Он был разработан в 1984–1986 годах американским биохимиком Кэри Муллисом [248] и принес своему изобретателю Нобелевскую премию. ПЦР позволяет в считанные часы размножить одну-единственную молекулу ДНК определенной последовательности до миллиарда копий.

Эта реакция стала возможной благодаря открытию бактерий, живущих в горячих источниках. ДНК-полимераза человека может достраивать вторую цепочку ДНК при температуре тела около 36 градусов. А вот у термофильных бактерий в результате эволюции появились ДНК-полимеразы, работающие при более высоких температурах, например при 72 градусах, и не разрушающиеся даже при очень высоких температурах порядка 95 градусов. Для проведения ПЦР нам понадобится именно такая термофильная полимераза, а также три чайника. В принципе можно было бы обойтись и одним чайником, а на практике и вовсе использовать программируемые термостаты, но так нам будет проще описать процедуру.

248

Mullis K. et al.: Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, 51 Pt 1:263–73.

Для

работы ДНК-полимеразы, кроме правильной температуры, необходимы следующие компоненты: выделенная из образца ДНК, предположительно содержащая фрагмент, который мы собираемся размножить, свободные нуклеотиды (а точнее дезоксинуклеозидтрифосфаты, но давайте не будем использовать точную терминологию), специальная буферная смесь, содержащая различные ионы, необходимые для работы фермента. Наконец, нужны особые затравки, праймеры, про которые придется сказать несколько слов отдельно.

Вот наш ген Cry-токсина. Но на этот раз запишем его в виде двух комплементарных цепей молекулы ДНК, одну под другой. Точки отображают пропущенный фрагмент середины гена.

В этой записи появились названия двух концов цепочки ДНК: 5’ и 3’. ДНК-полимераза умеет присоединять нуклеотиды только к 3’-концу строящейся цепочки молекулы ДНК. Кроме того, ДНК-полимераза не умеет синтезировать ДНК с нуля, ей нужна затравка (праймер), комплементарная 3’-концу уже имеющейся цепочки ДНК, которую предстоит удвоить. Полимераза начинает достраивать нужную цепь, прикрепляя нуклеотиды к 3’-концу праймера. В живых клетках праймеры состоят из РНК и синтезируются особой РНК-полимеразой (которой затравка не нужна). Но мы будем использовать ДНК-праймеры, которые синтезируют химически в лаборатории, путем последовательного присоединения нуклеотидов друг к другу. Праймеры подбираются таким образом, чтобы между ними находился анализируемый нами ген или его фрагмент. Нам понадобятся два типа праймеров, изображенные ниже (стрелки показывают направления достраивания цепочек ДНК).

Один праймер комплементарен 3’-концу левой части анализируемого фрагмента, а второй праймер комплементарен З’-концу его правой части. Концентрация праймеров должна быть высокой, зато исходного умножаемого фрагмента ДНК может быть хоть одна-единственная молекула.

Смешаем все вышеупомянутые компоненты вместе с праймерами и ДНК-полимеразой из термофильной бактерии в пробирке и вернемся к нашим трем чайникам. В первом чайнике мы будем поддерживать температуру порядка 95 градусов. При такой температуре молекула ДНК денатурирует: превращается из двухцепочечной молекулы в две одноцепочечные. Поместим туда нашу пробирку.

Во втором чайнике температура будет 58 градусов. Это оптимальная температура для специфичного присоединения наших праймеров, поэтому, когда мы поместим туда нашу пробирку со смесью, праймеры прилипнут к ДНК по принципу комплементарности.

В третьем чайнике у нас будет температура 72 градуса, идеальная для работы ДНК-полимеразы термофильных бактерий. Когда мы поместим нашу пробирку туда, полимераза достроит молекулу ДНК до двойной цепочки.

Была одна двухцепочечная молекула, а стало две. После этого мы снова помещаем пробирку в чайник при температуре 95 градусов, и цикл повторяется. Один цикл может занимать всего несколько минут, за час можно повторить все около двадцати раз, то есть увеличить концентрацию исходной молекулы в миллион раз. С обычной полимеразой, работающей при температуре 30–40 градусов, такая процедура не прошла бы по двум причинам. Во-первых, сама полимераза оказалась бы разрушена при высокой температуре, необходимой для разделения цепочек ДНК. Нам бы пришлось каждый раз добавлять полимеразу в реакционную смесь заново. Во-вторых, при низкой температуре праймеры будут прилипать не только к той цепи ДНК, с которой они полностью комплементарны, но и к похожим фрагментам, а значит, мы рискуем умножить не ту последовательность ДНК, которую хотели. Специфичность метода была бы намного ниже.