Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3
Шрифт:
Обогащение осуществляется при прокачивании раствора пробы через капилляр, при этом гидрофильные молекулы пробы адсорбируются в режиме обращенной фазы и могут быть десорбированы после ввода пробы с помощью метанола или ацетонитрила. При этом растворитель может переноситься к стационарной фазе как с помощью давления, так и с помощью ЭОП При этом, однако, важно, чтобы пространство между стационарной фазой и детектором заполнялось разделительным буфером. Преимуществом этого метода является его пригодность для неионной гидрофобной пробы. Эта техника, однако, из-за плохой воспроизводимости, а также из-за высокой стоимости разделительного капилляра мало распространена. Обзор методов снижения порога обнаружения при КЭ за счет концентрирования пробы в режиме реального времени дан в таблице 11.
6.4.
Термостатирование служит главным образом отведению джоулева тепла. Воздушные и жидкостные термостаты находят применение в коммерческих приборах, где температура может изменяться от 15 °C до 60 °C. Помимо охлаждения капилляра за счет окружающего воздуха, имеются также хорошо разработанные методы отвода джоулева тепла от капилляра. В большинстве случаев отвод тепла достигается за счет сильного воздушного охлаждения, при котором капилляр обдувается воздухом со скоростью до 20 см/с. Еще эффективней отвод тепла с помощью охлаждающей жидкости (тепловое сопротивление 2.5•10– 4 В/см*К) вместо воздуха. Она будет омывать кроме этого "вход" около детектора и "выход" около капилляра. При этом с водой можно работать до разделительного напряжения 15 кВ, для более высокого напряжения применяют дорогостоящие фторуглеводороды. Влияние температуры на эффективность и селективность разделения в настоящее время еще обсуждается. По этой причине в случае коммерческих приборов термостатируются только капилляры (или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. Для разделения фрагментов ДНК в заполненных гелем капиллярах было показано, что хотя с повышением температуры производительность разделения снижается, относительная миграция, т. е. селективность разделения, может улучшиться. Дополнительно к термостатированию капилляра в некоторых приборах имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы. Это особенно полезно при анализе термолабильных проб. Недостатком этих конструкций является то, что помимо пробы охлаждается также разделительный буфер и поэтому существует разность между температурой разделительного буфера и выбранной температурой разделительного капилляра.
6.5. Детектирование
При детектировании в КЭ компоненты пробы проходят через часть капилляра, в которой происходит детектирование в режиме реального времени или детектируются на конце капилляра в режиме с разделением времени. При этом, в отличие от хроматографии, необходимо обратить внимание на то, что через детектор пробы движутся с различными скоростями.
6.5.1. Уф-детектирование
Большинство аппаратурных требований не в последнюю очередь относятся к детектированию, так как при детектировании непосредственно в колонке УФ-поглощение происходит в слое очень малой толщины. Несмотря на это, наиболее часто применяемыми детекторами для измерения УФ-поглощения являются детекторы, применяемые в ВЭЖХ. Из-за очень малой толщины слоя (средняя величина внутреннего диаметра капилляра) к детекторам предъявляются высокие требования, касающиеся чувствительности, шумов, влияния светорассеяния и т. д. Для того, чтобы избежать потери эффективности из-за смешивания вне капилляра, детектирование осуществляют прямо в капилляре.
Типичная ширина зоны в капилляре находится в пределах 5 мм (N = 500000), что соответствует объему 10 нл (капилляр диаметром 50 мкм). Этот крайне малый объем является также причиной очень высокой чувствительности по массе, часто встречающейся в рекламе. Мировым рекордом является в настоящее время порог обнаружения в 300 молекул при отношении сигнал/шум три к одному для аминокислот и индуцируемой лазером флуоресценции. Для рутинного применения, однако, более важна концентрационная чувствительность. Она более чем скромна из-за короткого пути поглощения (средний диаметр капилляра).
При УФ-детектировании в КЭ концентрационная чувствительность в 30-100 раз ниже, чем в ВЭЖХ. Это зависит для поперечно облучаемых капилляров от шумов детектора и эффективной толщины слоя, которая отличается от номинальной (равной диаметру капилляра) в сторону уменьшения. Заметно мешает также частичное светорассеяние из-за несовершенной фокусировки (свет стенок капилляра) и неидеальной цилиндрической формы капилляра.
Рис. 25. А) апертурная диафрагма шириной 50 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм; В) апертурная диафрагма шириной 145 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм; С) апертурная диафрагма шириной 350 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм; D) с линзой, капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диаметром 275 мкм; Е) с линзой, капилляр с внутренним диаметром SO мкм и внешним диаметром 350 мкм.
Большинство фирм-производителей применяют поэтому или фокусирующие системы линз, которые освещают область капилляра примерно в 0.5 нм и меньше, или щели, которые имеют ширину от 50 до 200 мкм и длину от 100 до 300 мкм.
Существует много примеров улучшения чувствительности при УФ-опредёлении в КЭ за счет увеличения толщины слоя детектирования Чтобы увеличить толщину слоя и снизить границу обнаружения, были протестированы различные экспериментальные разработки.
Помимо применения капилляров прямоугольной формы, было также изучено применение в КЭ известных из микро-ВЭЖХ Z-ячеек.
Применение прямоугольных капилляров улучшает детектирование примерно в 10 раз. Практическая польза этого улучшения может не реализоваться из-за больших проблем при вводе пробы.
Применение Z-ячейки в КЭ не повышает чувствительность определения, так как помимо сигнала за счет светорассеяния также сильно увеличиваются шумы. Новейшие разработки этих систем показывают, что за счет сферической линзы на стороне источника света непосредственно перед изломом капилляра светорассеяние может быть минимизированно. Благодаря этому можно достигнуть улучшения чувствительности примерно в 11 раз для Z-ячейки с длиной светового пути 3 мм. При выбранной длине пути 3 мм отсутствия влияния или очень малое влияние на эффективность следует ожидать только для "широких" пиков. Из ВЭЖХ известно, что объем пика должен быть в 5 раз больше, чем объем ячейки детектора. Это означало бы для ячейки длиной 3 мм в КЭ, что пик должен иметь в капилляре ширину 1.5 см. Однако, поскольку в капиллярном электрофорезе происходит детектирование в режиме реального времени, и благодаря малому объему ячейки детектора и отсутствию соединительных элементов размывания зон не происходит, это правило, конечно, не вполне применимо.
Удлинение участка детектирования, как в случае описанной Z-ячейки со световым путем 3 мм, имеет определенное влияние на эффективность и, как следствие, на разделение зон пробы, особенно, если в течение короткого времени анализа достигается высокая эффективность. При эффективности анализа 500 тыс. теоретических тарелок и времени миграции 5 минут от начала колонки до ячейки детектора ширина пика составляет 1.0 мм.
Это отчетливо указывает на несоответствие между объемами детектирования и пика в Z-ячейках, Такие проблемы менее существенны в капиллярах с ячейкой детектирования, имеющей форму пузырька, так как объем пика при прохождении ячейки детектирования остается приблизительно постоянным, и длина пика в капилляре будет сокращаться. Поэтому с увеличением внутреннего диаметра длина пика автоматически сокращается. Это относится не только к прохождению зон веществ через ячейку детектора, но также и к электрофоретическому перемещению веществ, так как они перемещаются вдоль линий поля через весь объем ячейки детектирования.
Рис. 26 показывает структуру и расположение стандартных блоков детекторов с одной длиной волны, сканирующих детекторов, а также ДМД.
Рис. 26. Путь света различных УФ-детекторов для КЭ.
А — детектор одной длины волны с ртутной лампой (1), фильтр (5); В — многоволновой детектор с дейтериевой и вольфрамовыми лампами (2), поворачиваемое зеркало (3) и решеточный монохроматор (6); С — быстросканирующий детектор с вращающимся решеточным монохроматором; D — ДМД (8).