Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Журнал «Домашняя лаборатория»

Особенно важным становится подавление адсорбции на стенках при разделении белков с помощью КЭ. В этом случае можно показать, что уже повышение емкостного отношения (как меры адсорбции на стенках) с 0.001 до 0,1 приводит к росту высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) с 0.5 мкм до 15 мкм.

При повторных вводах растворов, содержащих белок, часто наблюдается изменение времени выхода. Для раствора проблема решается в основном двумя различными способами. Согласно первому можно связать ковалентно с поверхностью капилляра гидрофильный слой, второй состоит в возможности добавления к разделительному буферу веществ, которые препятствовали

бы ионному обмену.

В представленном на рис. 17 примере разделения белков ионообменное взаимодействие между стенками капилляра и молекулами белка подавляется введением в буфер добавок ДАП (1,3-диаминопропана). Из-за экранирующего действия ДАП пик лизоцима при повышении концентрации ДАП всегда симметричен, и при этом даже возрастает высота пика.

С улучшением симметрии пиков, обусловленным малой адсорбцией на стенках, сильно уменьшается разбавление веществ и пик становится выше. Поэтому снижения границы обнаружения можно добиться не только улучшая детектирование, но также в значительной мере за счет сокращения уширения полос. Этот пример ясно показывает, что только для пиков с высокой интенсивностью (малым разбавлением) достигается низкий порог обнаружения.

Из-за высокой концентрации добавок электропроводность буфера становится такой большой, что для разделения белков можно применять поле только небольшой напряженности, что ведет к удлинению времени анализа.

Устранение адсорбции на стенках будет более подробно описано в разделе, посвященном разделению белков.

5.5. Перегрузка системы разделения

Явление перегрузки наблюдается тогда, когда в систему разделения вводится слишком большое количество пробы. Так как в КЭ нет стационарной фазы, а разделительный объем ограничивается несколькими мкл, легко наступает явление перегрузки. Прежде всего, к перегрузке может привести неправильная регулировка прибора или слишком большая концентрация пробы. В качестве рабочего правила можно принять, что пробой может быть заполнено максимум 1–2 % от объема капилляра. Для капилляра длиной 50 см это соответствует максимальной длине зоны пробы 10 мм.

Рис. 17. Уширение полос из-за, адсорбции на стенках…

_{Условия: капилляр — 50 мкм; 42/50 см; поле — 300 В/см; буфер — 50 мМ фосфат, 20 мМ сульфат лития, 10–50 мМ МП; pH 3.5, ввод пробы давлением, 1 с.; детектирование — 214 нм; проба -0,5 мг/мл лизоцим.}

Наряду с объемной перегрузкой в случае слишком больших времен ввода при высокой концентрации пробы наблюдается также перегрузка по массе. Перегрузка по массе отчетливо видна при рассмотрении зависимости значения Н от концентрации пробы. При равном времени ввода проб увеличивается только количество введенной пробы, а не ее объем. Доля ?_VU как вклада в уширение полос остается при этом постоянной. В качестве примера на рис. 18 показан эффект перегрузки из-за большого объема и высокой концентрации пробы.

Время ввода пробы повышается с 1 до 5 с, так что, хотя порог обнаружения и понижается примерно до 0.2 мМ, одновременно возрастает значение

Н, поэтому вклад перегрузки по объему увеличивается. Отсюда видно, что вкладом перегрузки по объему в уширение полос пренебречь нельзя Даже при маленькой концентрации в области, в которой можно пренебречь перегрузкой по массе, значение Н остается при вводе пробы за 5 с больше, чем при вводе за 1 с.

Низкий порог обнаружения при вводе больших объемов пробы нивелируется сильным уширением полос (таблица 4) и связанными с этим трудностями разделения соседних пиков.

Рис. 18. Эффект перегрузки из-за большого объема и концентрации пробы.

_{Условия: прибор для КЭ — Beckman Р/АСЕ; капилляр — 75 мкм, 65/72 см; поле — 347 В/см; буфер А — 70 мМ борат, pH 8.5; буфер В — 40 мМ борат, pH 8.5; ввод пробы давлением, I или 5 с; проба фенилтриметидаммонийхлорид.}

5.6. Наложение профилей потока

При разделении в КЭ всегда надо обращать внимание на то, чтобы не было разницы в уровнях между обоими сосудами с электролитом. Даже при незначительной разнице уровней в капилляре возникает течение, которое приводит к параболическому профилю потока. Этот эффект вызывает дополнительный вклад в уширение полос и сильно зависит от радиуса капилляра. В то время как в случае капилляра с внутренним диаметром 25 мкм этим эффектом можно практически пренебречь, в капилляре диаметром 100 мкм этот эффект сильно ухудшает эффективность разделения и оказывает влияние на разрешение пиков.

5.7. Резюме

Важнейшие причины уширения полос в КЭ представлены в таблице 5.

Таблица 5. Основные причины уширения полос

Причина уширения полос • Примечание

Продольная диффузия • Соответствует теоретическому пределу; увеличивается с уменьшением ММ и с увеличением времени анализа

Термические эффекты • Приводят к конвекции и к локальным изменениям вязкости буфера

Длительность ввода пробы • Должна быть меньше, чем зона, возникающая в результате диффузии; может увеличиваться для того, чтобы снизить порог обнаружения.

Адсорбция пробы на стенках • Причина появления пиков с "хвостами" и плохой воспроизводимости времени миграции

Электродисперсия (различие в подвижностях) • Причина треугольной формы пиков

Различие в уровнях жидкости • Гидродинамический поток с соответствующим профилем потока

6. Аппаратура

Аппаратура для КЭ появилась в продаже с 1988 года, количество предложений постоянно растет. Отдельные приборы принципиальных различий не имеют, так как сами системы разделения очень просты. Различия связаны с вводом пробы, а также числом и видом предлагаемых детекторов. Здесь не дается обзор рынка, а приводятся только типичные требования, предъявляемые к различным элементам аппаратуры.

Обзор рынка дается в журнале Nachr. Tech. Lab. (март 1993).

6.1. Источники напряжения