Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир
Шрифт:
Статья Даудны и Шарпантье, представленная на рассмотрение в престижный журнал Science 8 июня 2012 года и опубликованная онлайн 28 июня, привлекла огромное внимание: было очевидно, что в ней описано открытие с грандиозным потенциалом. Исследовательницы получили по 3 миллиона долларов, став в 2015 году лауреатами Премии за прорыв в области естественных наук, учрежденной Марком Цукербергом из Facebook [67] , Сергеем Брином из Google и другими титанами технологий. Церемония вручения премии проходит ежегодно среди знаменитостей в Кремниевой долине22.
67
Деятельность корпорации Meta Inc (Facebook, Instagram) решением российского суда признана экстремистской и запрещена
Но вернемся в 2012 год. Исследовательская группа, возглавляемая Виргиниюсом Шикшнисом из Вильнюсского университета, 6 апреля представила в научный журнал свою статью, где тоже описывала процесс расщепления ДНК in vitro системой CRISPR/Cas9 с проводником в виде вариации tracrРНК/crРНК, но не единой молекулы, а двух РНК-фрагментов23. Статья завершалась сходным выводом: полученные результаты «прокладывают путь к разработке универсальной, программируемой, направляемой РНК» платформы для манипуляций с ДНК. Рукопись бесцеремонно отвергли, и авторы отправили ее в другой журнал. В итоге работу опубликовали лишь в конце сентября, на три месяца позже статьи Даудны и Шарпантье. В науке признание обычно достается тому, кто пришел к финишу первым, и Шикшниса порой называют «забытым человеком CRISPR». Правда, в 2018 году он разделил с Даудной и Шарпантье премию Кавли в области нанотехнологий, размер которой составлял миллион долларов США24. Не приходилось сомневаться, что открытие CRISPR принесет кому-то Нобелевскую премию, вопрос был только, кому и когда. Ответ получили в 2020-м: нобелевскими лауреатами в области химии стали Даудна и Шарпантье.
После первых статей 2012 года появилось множество других, написанных разными научными группами. Так, в 2013-м лаборатории Фэна Чжана (Институт Эли и Эдит Броуд при Массачусетском технологическом институте и Гарварде) и Джорджа Чёрча (Гарвардская медицинская школа) продемонстрировали работу CRISPR/Cas9 в культурах клеток мышей и человека25. Подобно грибам после дождя, в прессе то и дело появлялись материалы, рассчитанные на широкую публику: к 2019 году одна только The New York Times опубликовала больше 100 статей с упоминанием CRISPR. Можно еще многое рассказать об истории изучения CRISPR/Cas, в том числе и о патентных спорах и драмах, проливающих свет на бизнес-составляющую современной науки, однако моя цель – разобрать научную составляющую методов и спектр их применений, а потому вернемся к науке.
Пока что мы изображали систему CRISPR/Cas9 исключительно деструктивной, расщепляющей ДНК в нужном месте. Благодаря этому ее свойству мы можем инактивировать ген. Клетки обладают механизмами выявления и починки повреждений ДНК. Такие системы репарации необходимы прежде всего для устранения дефектов, рутинно возникающих в ходе репликации ДНК, а также под действием побочных продуктов обмена веществ или физических факторов вроде ультрафиолета. Восстановлением ДНК занимаются белки, сшивающие друг с другом концы рассеченных цепей. Но при этом нередко возникают ошибки: нуклеотиды на стыке могут замениться, добавиться или выпасть. Такие ошибки часто приводят к синтезу нефункционального белка.
Природный инструментарий починки ДНК можно использовать и более конструктивно – например, для внедрения в геном новых последовательностей. Мы можем ввести в клетку фрагменты ДНК с любым желательным для нас геном. Ремонтные белки непривередливы: они сшивают любые концы ДНК, которые находят, – и с их помощью один из наших фрагментов может попасть в разрыв цепей и с обеих сторон соединиться с геномом. Возможно, вы уловите в выражении «может попасть» немало неопределенности, и будете правы: вероятностная природа микроскопического мира здесь проявляется сполна. Расщепленные Cas9 свободные концы ДНК перемещаются по законам броуновского движения. Белки, которые выявляют и чинят поврежденную ДНК, тоже блуждают. Какую пару они найдут раньше – свободный конец геномной ДНК и конец введенного в клетку фрагмента либо два свободных конца генома, – зависит от траектории их случайных перемещений, хотя мы и можем влиять на результат введением в клетку множества копий нужного гена, и тогда белок с большей вероятностью наткнется именно на него. Cas9 между тем останется в клетке – он может опять найти свою ДНК-мишень, расщепить ее и повторять процесс снова и снова. У нас есть шанс получить желаемый результат, но нет в этом уверенности. Как и в случае старых методов, нам придется совершить много ошибок, прежде чем мы добьемся успеха. Тем не менее, если все выходит как задумано, этот метод позволяет поместить наш ген ровно в то место генома, где мы хотим его видеть.
Хотя программируемые системы CRISPR/Cas9 появились от силы 10 лет назад, ученые уже изобрели более удобные схемы внедрения генетического материала. Перспективный метод праймированного редактирования, разработанный в 2019 году группой Дэвида Лю из Института Эли и Эдит Броуд, задействует широкий спектр клеточных механизмов26. Я не буду вдаваться в детали, но по сути он сплавляет модифицированный Cas9 с обратной транскриптазой – белком, формирующим ДНК на матрице РНК (см. главу 13), – и включает в РНК-гид ту самую матрицу для внедряемой, измененной по сравнению с геномной последовательности ДНК. Химера из Cas9 и обратной транскриптазы узнает и разрезает в нужном месте одну из цепей геномной ДНК, а затем в месте разреза синтезирует по матрице гидовой РНК новую ДНК, уже с желаемыми изменениями. Лишний фрагмент старой цепи должны отрезать клеточные ферменты. Рисунок дает общее представление об этом многоэтапном процессе [68] : ДНК обозначена черным, РНК – серым, на измененную последовательность указывают стрелки; белок не представлен.
68
Подробнее на русском языке процесс описан, например, в заметке: https://nplus1.ru/news/2019/10/21/prime-editing. Визуально поясняют заметку короткие анимации: https://www.youtube.com/watch?v=FzVV-AkS76I и https://www.youtube.com/watch?v=Ag4nSw3Z_Lk.
Группа Лю успешно применила праймированное редактирование в клеточных культурах мыши и человека и отметила, что эта техника принципиально пригодна для исправления 89 % генетических вариантов, ассоциированных с болезнями человека. (В оставшиеся 11 % входят, например, множественные копии генов, с которыми не справиться простым переписыванием участка ДНК.)
В этой искусной подгонке ДНК с помощью иголок и ниток – белков и нуклеотидов – находит отражение физическая природа биологических молекул. ДНК – это носитель генетической информации, и чтобы изменить эту информацию, мы создаем инструменты, позволяющие нам без визуального контроля захватывать, разрезать, вставлять и сшивать ДНК-фрагменты. Точность операций поражает даже с небиологической точки зрения. Размеры некоторых деталей новейших компьютерных микросхем не превышают 10 нанометров. Длина одного нуклеотида ДНК составляет около 1/3 нанометра, но его можно контролируемо заменять с помощью праймированного редактирования и других новейших подходов.
Как мы узнали, активность клетки определяется не только физическим присутствием в ней какого-либо гена. Важнейшую роль играет регуляция – контроль разных этапов реализации закодированной в нем информации (см. главу 4). Ученые уже придумали, как использовать CRISPR/Cas9 для программирования регуляторных механизмов. И снова гидовая РНК этой системы служит проводником к геномным мишеням. А вот вместо стандартного белка Cas9 здесь работают его модифицированные формы, не способные расщеплять ДНК. Чтобы отключить целевой ген, лишенный нуклеазной активности Cas9 должен просто сесть в нужном месте на ДНК и помешать работе РНК-полимеразы, как это делает обычный репрессор. Такую технику использует описанный в главе 9 переключатель, который лишает бактерию возможности направленно плыть. Но гены можно и включать – например, привязывая безнуклеазный Cas9 к активаторам транскрипции, которые рекрутируют РНК-полимеразу. Таким образом, благодаря CRISPR у нас появился удобный доступ не только к геномам, но и к их регуляторным схемам.
Методы на базе CRISPR позволяют легче и изящнее изменять растения, которые тысячи лет служили мишенями генетических манипуляций. Предок помидора, который по-прежнему встречается в дикой природе, дает плоды размером с горошину. В ходе одомашнивания растения его плоды становились крупнее и питательнее – так получились знакомые нам томаты. Избирательное скрещивание позволило нам отобрать предпочтительные генетические варианты, но за традиционную селекцию мы расплачиваемся снижением генетического разнообразия и устойчивости растений к стрессам, характерной для их дикого родственника. В 2018 году ученые применили систему CRISPR/Cas9, чтобы встроить в геном дикого растения всего четыре гена одомашненных томатов27. В результате оно дало плоды массой втрое больше обычной. Точность CRISPR не только бережет целостность генома, но и не допускает переноса потенциально нежелательных сцепленных генов – побочного эффекта традиционной селекции (мы видели похожее сцепление у арбуза).
Но, разумеется, больше всего нас заботит собственный организм. Медицинские подходы на базе генетического редактирования разрабатывают и внедряют с головокружительной быстротой. Эти техники не только приносят пользу, но и проливают свет на тонкости практического применения редактирующих инструментов. Чтобы системы CRISPR/Cas9 могли вырезать и вставлять фрагменты генома, эти молекулярные машины должны попадать внутрь клеток, которые мы хотим модифицировать. Лучше всего с этой задачей справляются вирусы, специально доработанные для переноса ДНК, которая кодирует белок Cas9 и необходимые последовательности РНК. Вирусы автоматически распознают клетки-мишени, прикрепляются к ним и затем проникают внутрь.