Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей
Шрифт:
Вырежем нужный нам фрагмент ДНК с помощью двух рестриктаз. Добавим вырезанный фрагмент к плазмиде, в которой были сделаны разрезы такими же рестриктазами. «Липкие» концы плазмиды и нашего фрагмента сблизятся по принципу комплементарности, а ДНК-лигаза их сошьет. В итоге мы получим плазмиду со вставкой.
Зачем бактериям рестриктазы и не могут ли они порезать свой собственный геном? Оказывается, что эти ферменты — отличное средство от чужеродной ДНК. Допустим, у бактерии есть рестриктаза, которая узнает фрагмент GAATTC и разрезает его. Сама бактерия пришла к такой рестриктазе постепенно, в процессе длительной эволюции, поэтому у нее в геноме крайне мало участков GAATTC. Кроме того, у нее могут быть особые ферменты, которые находят участки GAATTC и прикрепляют
Если же в бактерию проникнет неприспособленный бактериофаг, то, вероятно, в его геноме найдется незащищенный участок GAATTC и вирус будет беспощадно разрезан.
Для завершения задуманного генно-инженерного проекта понадобятся правильные бактерии. В обычных условиях менее одного процента бактерий готовы захватывать плазмиды. Для того чтобы увеличить эффективность передачи плазмид, бактерии стоит предварительно подвергнуть тепловому шоку. Сначала их держат в прохладных условиях, а потом ненадолго помещают в инкубатор с температурой в районе 42 градусов (разумеется, конкретные значения зависят от вида используемых бактерий). Многие бактерии в результате такого шока переключаются в особый режим, в котором они начинают хватать всякую ДНК из окружающей среды в надежде найти что-нибудь, что поможет им приспособиться и выжить. В природе это способствует повышению генетического разнообразия популяции бактерий, а значит, возрастают шансы, что какие-то особи переживут неблагоприятные условия. Вот таких напуганных бактерий мы и перемешаем с плазмидой, а затем с антибиотиком. Бактерии, захватившие плазмиду с правильной вставкой, обретут устойчивость и выживут, а остальные погибнут.
Генетически модифицированных бактерий мы можем размножать дальше и использовать в разных целях. Если речь идет не о научных, а о развлекательных задачах, то разбавленными бактериями с генами флуоресцентных белков можно рисовать на поверхности из застывшей питательной среды. Причем если вывести бактерий с флуоресцентными белками разных цветов, рисунки можно делать цветными. Нанесенные бактерии со временем размножатся, и, посветив ультрафиолетом на наш «холст», мы увидим разноцветные картины. Подобные развлечения практикуются на занятиях в некоторых продвинутых зарубежных школах. Правда, обычно школьников не заставляют придумывать собственные плазмиды. Им предлагают уже готовые, проверенные плазмиды, с нужными генами и известным эффектом. Просто добавь бактерий! Подобным рисованием увлекаются не только дети, но и взрослые художники. В частности, создавались репродукции известных картин, таких как «Крик» Эдварда Мунка, «Большая волна в Канагаве» Кацусики Хокусая, «Звездная ночь» Винсента ван Гога, нарисованные при помощи бактерий.
Генетически модифицировать растения и животных с помощью плазмид проблематично. Дело в том, что для размножения плазмид внутри клеток должны присутствовать специальные белки. У бактерий они есть, но у растений и животных они отсутствуют. Мы можем засунуть бактериальную плазмиду в клетку и даже заставить ее гены работать, но если клетка будет делиться, со временем большинство ее потомков окажутся без плазмиды. Именно поэтому методы генной инженерии растений и животных чаще всего требуют внедрения конструкции непосредственно в геном.
В связи с этим пора перейти к более серьезному вооружению для генной модификации. Например, к генной пушке! Звучит фантастично, не правда ли? Похожим образом (согласно легенде) рассудили в компании Monsanto, когда к ним впервые пришли с такой идеей. Представители компании послали изобретателей на все четыре стороны, и эта ошибка обошлась впоследствии в миллионы долларов. В 1987 году в журнале Science вышла статья, доказывающая, что генная пушка реальна, работает и доставляет кусочки ДНК, содержащие гены, в живые клетки [307] . Первая генная пушка была похожа на ружье 22-го калибра, стреляющее холостыми патронами. Пороховой взрыв приводил в движение нейлоновый снаряд. Снаряд начинал двигаться вдоль ствола пушки, толкая перед собой микроскопические частички вольфрама, на которые нанесены фрагменты двухцепочечной ДНК. В конце ствола стояла стальная пластина, которая останавливала нейлоновый снаряд, а частицы с генами пролетали через отверстия в пластине диаметром в миллиметр каждое. Скорость полета частиц могла достигать тысячи километров в час! Пролетев сквозь клеточные стенки и мембраны, фрагменты ДНК, содержащие гены (со всеми необходимыми промоторами), начинали работать, а иногда, оказавшись рядом с наследственным материалом клеток, встраивались в их
307
Klein R.M. et al.: High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. 1987. Biotechnology 1992, 24:384–6.
Генная пушка — это универсальный метод, позволяющий доставлять ДНК (или РНК) практически в любые клетки, будь то клетки животных, растений или бактерий. Основным недостатком метода до недавнего времени считалась стоимость генной пушки, которая могла доходить до 15 тысяч долларов. Однако «биохакер» Рюдигер Тройок создал ее упрощенный аналог ценой всего в 50 евро. Сначала он попробовал смастерить пушку, в основе которой лежали найденная в лесу деревянная палка, электрические клапаны (их он откопал в каком-то мусорном баке), капсула для накачивания велосипедных шин со сжатым углекислым газом, дешевый микроконтроллер и пластиковые трубки. Ствол пушки был сделан из корпуса пишущей ручки и с помощью трубки соединен с клапаном, внутри которого были расположены частички золота, смазанные ДНК и помещенные на пластиковый носитель.
Когда первый прототип не выдержал созданного в нем давления и сломался, Тройок просто соединил ствол своей генной пушки с распылителем для взбитых сливок (баллончик с веселящим газом, находящимся под давлением) — и готово. По заявлению Тройока, устройство могло придать частицам достаточную скорость для проникновения внутрь клеток лука. Конечно, эта пушка далека от совершенства, но сделать недорогую высококачественную генную пушку в принципе возможно, и скоро они появятся в широком доступе, если на них будет увеличиваться спрос.
Еще одна особенность генной пушки заключается в том, что фрагменты ДНК могут попадать в самые разные части клетки. В том числе в митохондрии, хлоропласты и другие внутриклеточные структуры. Это нежелательно, если мы хотим модифицировать ядерную ДНК клетки, но полезно, если мы хотим внести ген в сами митохондрии или хлоропласты [308] . Нежелательный эффект — обстрелянные из генных пушек клетки могут повреждаться. Какие-то клетки получат частички с ДНК, а какие-то мы просто повредим напрасно. Некоторым клеткам не достанется ни одной молекулы ДНК, а другим десятки. Наконец, ДНК встроится в геном лишь небольшой части клеток. Впоследствии придется тщательно отбирать те уцелевшие клетки, в которых генная модификация прошла успешно.
308
Daniell H. et al.: Transient foreign gene expression in chloroplasts of cultured tobacco cells after biolistic delivery of chloroplast vectors. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87(1):88–92.
Обычно для генной инженерии растений выбираются особые клетки, которые называются каллусом. Каллус помещают в питательную среду, а потом подвергают обстрелу из генной пушки. Клетки каллуса многофункциональные, неспециализированные, из них можно получить целое растение путем вегетативного размножения. Если растение получено из генетически модифицированной клетки каллуса, оно будет целиком генетически модифицированным и станет давать соответствующее потомство.
В основе еще одного метода генной инженерии лежит использование почвенной агробактерии Agrobacterium tumefaciens. Ключевую роль в процессе генной модификации растительных клеток играет Ti– плазмида этой бактерии. Ее можно сравнить с маленькой передвижной подпольной лабораторией по генной инженерии, которую бактерия таскает с собой. Ti– плазмида кодирует целый арсенал белков, необходимых для доставки ДНК в растительную клетку, а также содержит особый участок, который называется Т-ДНК. Когда бактерия оказывается рядом с растительной клеткой, между ними образуется канал. Тем временем в бактерии создается копия Т-ДНК и синтезируются белки, которые связываются с Т-ДНК, помогают ей пройти по каналу внутрь растительной клетки, а дальше в ее ядро, где они создают разрезы в геномной ДНК растения и интегрируют Т-ДНК в одну из хромосом.
Бактериальные белки переносят не любую ДНК, а именно Т-ДНК, потому что она содержит особые последовательности, которые узнаются вышеупомянутыми белками Ti-плазмиды. В природе Т-ДНК содержит набор генов, которые, оказавшись в растительном геноме, заставляют клетки активно делиться и производить для бактерий питательные вещества. В результате на зараженных тканях растения образуются опухоли — корончатые галлы (в чем-то похожие на клубеньки). Но не стоит их путать с раковыми опухолями — там совсем другие молекулярные механизмы.