ДНК. История генетической революции
Шрифт:
Сначала при помощи рестриктаз разрезали две неизмененные плазмиды. Затем эти плазмиды смешивались в одной пробирке, куда добавлялся фермент лигаза, которая должна была запустить склеивание обрезанных концевых остатков. Некоторые молекулы в пробирке под действием лигазы просто восстанавливали целостность – то есть склеивались два концевых остатка одной и той же плазмиды. Но иногда лигаза срабатывала так, что в разрезанную плазмиду попадали фрагменты ДНК другой плазмиды – так и получался желаемый гибрид. Когда эта задача была решена, требовалось внедрить все плазмиды в бактерии, и это успешно было проделано с использованием технологий Коэна. Полученные от рекомбинантов колонии выращивались на агаровых пластинах, покрытых одновременно тетрациклином и канамицином. Те плазмиды, которые просто восстановились свою структуру, по-прежнему обеспечивали устойчивость лишь к одному из двух антибиотиков, и, соответственно, бактерии с такими плазмидами не выживали в среде, содержащей два антибиотика. В такой среде могли выжить только бактерии с рекомбинантными плазмидами, сконструированными из двух имевшихся разновидностей ДНК, одна из которых
Герб Бойер и Стенли Коэн – первые в мире генные инженеры
Следующий вызов сложившемуся в обществе укладу заключался в создании гибридной плазмиды с использованием ДНК не бактерий, а иного организма, например человека. В одном из первых успешных экспериментов ген африканских шпорцевых лягушек удалось добавить в плазмиду E. coli и трансплантировать ее в бактерию. Всякий раз при делении клеток в такой бактериальной колонии реплицировался лягушачий фрагмент ДНК. Если не применять сложную молекулярно-биологическую терминологию, а просто описать происходящее, то это выглядит как «клонирование ДНК лягушки» [5] . Как стало известно, ДНК млекопитающих также успешно клонируется. Ретроспективный анализ показал, что в этом нет ничего особенно удивительного: любой фрагмент ДНК – это, в конечном счете, просто ДНК, его химические свойства не изменяются в зависимости от источника. Вскоре стало понятно, что протоколы Коэна и Бойера, описывающие клонирование фрагментов ДНК, применимы к ДНК любого организма.
5
Термин «клонирование» означает создание множества идентичных образцов фрагмента ДНК, вставляемого в бактериальную клетку. Этим термином также именуется клонирование целых организмов, самый известный из которых – овечка Долли. В первом случае копируется лишь единственный участок ДНК, а во втором – целый геном.
Таким образом, разворачивался уже второй этап молекулярно-биологической революции. На первом этапе мы стремились описать статус и функционал ДНК в клетке, затем, после получения рекомбинантной ДНК [6] , появились реальные инструменты для вмешательства в работу ДНК и манипулирования ею. Был создан плацдарм для стремительного прогресса, а мы примерили на себя роли Творца. Полученные результаты пьянили: открывался огромный потенциал, позволявший глубоко погрузиться в тайны жизни и добиться успеха в борьбе с такими болезнями, как рак. Несмотря на то что работы Коэна и Бойера предоставили нам фантастические научные перспективы, – не открылся ли при этом ящик Пандоры? Не скрывалось ли в молекулярном клонировании какое-то неизвестное зло? Можно ли и далее беззаботно вшивать кусочки человеческой ДНК в E. coli, учитывая, какие огромные колонии этих бактерии обитают в «микробных джунглях» нашего кишечника? Что будет, если в кишечник проникнет видоизмененная бактерия? Короче говоря, можно ли, будучи в здравом уме, заткнуть уши и не слушать скептиков, заявляющих, что на глазах у всего научного мира мы творим бактерий-франкенштейнов?
6
Термин «рекомбинантная ДНК» немного неудачен, поскольку возникает путаница с «рекомбинацией», которую мы уже обсуждали в контексте классической генетики. В менделевской генетике рекомбинация связана с разделением и пересборкой хромосом, в результате чего все фрагменты хромосом «заново смешиваются». В молекулярной версии такое «смешивание» происходит в гораздо более мелком масштабе: два участка ДНК объединяются в одну составную молекулу.
Рекомбинантная ДНК: суть клонирования гена. A. Бактериальные плазмиды оказались идеальным носителем для клонирования ДНК; разрезая одной и той же рестриктазой интересующую нас ДНК и плазмиду, можно вставлять интересующую нас ДНК в плазмиду, как деталь в пазл. B. Внедрив эту рекомбинантную плазмиду в бактерию, можно реплицировать в бактериальной культуре интересующий нас ген – на основе таких приемов развились генная инженерия, секвенирование ДНК и биотехнологическая индустрия
Кишечная палочка E. coli. Представляете, около 10 миллионов этих существ обитает в каждом грамме человеческого кала
В 1961 году удалось выделить обезьяний вирус SV40 (SV означает «обезьяний вирус») из почек макак вида резус, использовавшихся при разработке вакцины против полиомиелита. Хотя и считалось, что этот вирус никак не влияет на мартышек, в организме которых встречается, вскоре дальнейшие эксперименты показали, что вирус может вызывать рак у грызунов, а в определенных лабораторных условиях – даже в человеческих клетках. Поскольку кампания по вакцинации от полиомиелита проводилась с 1955 года и миллионы американских детей уже были заражены этим вирусом, новость действительно была тревожной. Что если, искореняя полиомиелит, мы случайно обрекли целое поколение на риск развития онкологических заболеваний?
Пол Берг и его вирусная «хонда»
Тем временем Пол Берг из Медицинской школы Стэнфордского университета усматривал в вирусе SV40 скорее возможности, чем опасности: он предвидел, что этот вирус удастся использовать для внедрения фрагментов ДНК в клетки млекопитающих. Вирус мог бы работать у млекопитающих как молекулярная система доставки лекарств, именно так, как действовали плазмиды у бактерий в опытах Стенли – Коэна. Однако если Коэн, в сущности, использовал бактерии как копировальные аппараты, позволяющие «увеличить» нужный фрагмент ДНК, то Берг рассматривал SV40 как средство для внедрения корректировочных генов людям, страдающим от генетических заболеваний. Берг опередил свое время. Он стал вдохновителем практики, которая сегодня именуется «генотерапия» и заключается во введении нового генетического материала в организм живого человека с целью сгладить унаследованные генетические расстройства.
Пол Берг был приглашен в Стэнфорд в 1959 году на должность младшего профессора; переход произошел в рамках программы научного обмена, которая также привела в Стэнфорд еще более знаменитого Артура Корнберга из Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Действительно, связь между Бергом и Корнбергом прослеживается вплоть до того, что родились они оба в нью-йоркском районе Бруклин и там ходили в один и тот же естественнонаучный клуб для старшеклассников, которым руководила мисс Софи Вольфе. Берг вспоминал: «она умела сделать науку интересной, она помогала нам делиться идеями». На самом деле, это была скорее ее недооценка: из научного клуба мисс Вольфе при старшей школе им. Авраама Линкольна вышло трое нобелевских лауреатов: Артур Корнберг (1959), Пол Берг (1980) и кристаллограф Джером Карле (1985) – и все они отмечали, насколько существенное влияние на них оказала мисс Вольфе.
В то время как Коэн и Бойер, а вслед за ними и другие ученые уточняли детали, связанные с копированием и вставкой молекул ДНК, Берг планировал смелый эксперимент. Он решил проверить, можно ли использовать вирус SV40 с внедренным в него фрагментом чужеродной ДНК для доставки чужого гена в клетку животного. В качестве источника ДНК, не принадлежащей SV40, он воспользовался уже имевшимся под рукой бактериальным вирусом – бактериофагом. Требовалось выяснить, сможет ли молекулярная структура, состоящая из ДНК SV40 и бактериофага, успешно внедриться в животную клетку. Если же она внедрится, на что и надеялся Берг, появится возможность того, что такую систему со временем можно будет использовать для встраивания полезных генов в человеческие клетки.
Летом 1971 года в лаборатории Колд-Спринг-Харбор аспирант Берга выступил с презентацией планируемого эксперимента. Один из ученых, присутствовавших в аудитории, настолько встревожился, что сразу же позвонил Бергу. Он спросил: «А что, если этот механизм сработает прямо наоборот?» Иными словами, что, если вирус SV40 не станет принимать вирусную ДНК и затем встраивать ее в животную клетку, а сам попадет «под власть» ДНК бактериофага, в результате чего ДНК SV40 может внедриться, скажем, в ДНК бактериальной клетки E. coli? Такой сценарий не казался нереалистичным; в конце концов, именно на него и «запрограммированы» многие бактериофаги: они внедряют собственную ДНК в бактериальные клетки. Поскольку E. coli повсеместно распространена, а ее жизненный цикл тесно связан с жизнедеятельностью человека (ведь это один из основных микроорганизмов кишечной микробиоты человека), то благие намерения эксперимента Берга могли породить целые колонии опасных бактерий E. coli, несущих потенциально канцерогенный обезьяний вирус SV40. Берг прислушался к скептическим замечаниям коллеги, но не согласился с ними; он решил отложить эксперименты до тех пор, пока не будет подробно изучена потенциальная канцерогенность SV40 для человека.
Обеспокоенность по поводу смертельной угрозы, связанной с рекомбинантными технологиями, распространялась вслед за новостями об успешных опытах Бойера и Коэна. На научной конференции, посвященной нуклеиновым кислотам, состоявшейся в Нью-Гемпшире в 1973 году, большинством голосов была принята петиция к Национальной академии наук, в которой требовалось незамедлительно проанализировать угрозы, связанные с этой технологией. Через год комитет, назначенный Национальной академией и возглавляемый Полом Бергом, изложил свои выводы в письме, направленном в журнал Science. Я лично подписал это письмо, подписали его и многие другие, в том числе Коэн и Бойер, наиболее активно занимавшиеся соответствующими исследованиями. В этом документе, который позже стал известен под названием «Письмо о моратории», мы призывали «ученых всего мира» добровольно приостановить все исследования рекомбинантной ДНК «до более полной оценки потенциальных угроз, которые могут быть связаны с такими рекомбинантными молекулами ДНК, или до тех пор, пока не будут разработаны адекватные методы для предотвращения их распространения». В письме была важная оговорка о том, что «наши опасения базируются на суждениях о потенциальном, а не доказанном риске, поскольку экспериментальных данных об опасности рекомбинантных молекул ДНК пока недостаточно».