ДНК. История генетической революции
Шрифт:
Уолли Гилберт (вверху) и Фред Сенгер (внизу) – короли секвенирования
В университете и аспирантуре Гилберт занимался физикой, а в 1956 году, через год после моего прибытия в Гарвард, стал работать на физическом факультете. Когда же я увлек его опытами с РНК, которыми занимался у себя в лаборатории, Гилберт забросил свою дисциплину ради моей. Вдумчивый и непреклонный Гилберт успел немало поработать на переднем крае молекулярной биологии.
Однако из двух методов секвенирования проверку временем выдержал
Сенгер использовал не только обычные дезокси-основания (А, Т, Г и Ц), которые встречаются в естественной ДНК, но и так называемые дидезокси-основания. Основания второй категории обладают замечательным свойством: ДНК-полимераза с готовностью внедряет их в цепочку ДНК (то есть копия собирается по образцу матричной цепи). Однако, после того как в цепочку попадет дидезокси-основание, другие основания в нее добавляться больше не могут. Иными словами, скопированная нить не может достраиваться после дидезокси-основания.
Допустим, у нас имеется матричная цепь с последовательностью ГГЦЦТАГТА. В эксперименте используется множество копий такой спирали. Теперь представьте себе, что эта цепь копируется при помощи ДНК-полимеразы, но в растворе, кроме А, Т, Г и Ц, присутствует еще и дидезокси-А. Фермент работает, сначала добавляя к цепи Ц (комплементарный исходному Г), затем еще Ц, затем еще Г и еще Г. Однако, когда фермент добирается до первого Т, открываются два варианта: либо он добавит к растущей цепочке обычный А, либо дидезокси-А. Если фермент подберет дидезокси-А, то цепь далее расти не сможет и получится короткой, с дидезокси A в конце: ЦЦГГддА. Но существует также возможность того, что цепь подхватит обычное A, и в этом случае ДНК-полимераза продолжит добавлять основания: Т, Ц и так далее. Дидезокси-основание в следующий раз сможет «закоротить» цепочку не раньше, чем фермент дойдет до следующего Т. Здесь, опять же, цепочка может подхватить либо нормальное А, либо дидезокси А (ддА). При присоединении ддА цепочка тоже получится обрубленной, но чуть более длинной, чем в первый раз: у этой цепочки будет последовательность ЦЦГГАТЦддА. Подобное происходит всякий раз, когда цепь дорастает до Т и далее к ней может присоединиться А. Если случится так, что цепочка подхватит обычное А, то она продолжит расти, а если подхватит ддА – то на этом завершится.
Что же в итоге? После эксперимента у нас имеется целый набор цепочек разной длины, скопированных с матричной ДНК. Что у них общего? Все они оканчиваются основанием ддА.
Теперь вообразите, что все происходит аналогично и с тремя оставшимися основаниями; в случае Т у нас в растворе будут обычные А, Т, Г, Ц плюс ддТ. В результате будут получаться молекулы ЦЦГГАддТ либо ЦЦГГАТЦАддТ.
Проведя реакцию всеми четырьмя способами – сначала с ддА, затем с ддТ, после этого с ддГ и с ддЦ, – получим четыре набора цепочек ДНК. В первой группе все цепочки заканчиваются на ддА, во второй – на ддТ и так далее. Как можно рассортировать эти слегка различающиеся цепочки в зависимости от слегка различающейся длины так, чтобы можно было логически вывести длину цепочки? Во-первых, можно организовать сортировку, уложив ДНК на пластинку, обработанную специальным гелем, а саму пластинку поместить в электрическое поле. Под действием электрического поля молекулы ДНК рассредоточатся по гелю. Скорость движения каждой цепочки есть функция ее длины – короткие цепочки движутся быстрее длинных. В течение фиксированного промежутка времени самый короткий фрагмент – в нашем случае ддЦ – уйдет дальше всех; чуть более длинный ЦддЦ уйдет не так далеко, а еще чуть более длинный ЦЦддГ пройдет еще меньший отрезок пути. Теперь вы догадываетесь, какой трюк применил Сенгер. Фиксируя относительные позиции всех этих мини-цепочек, движущихся сквозь гель, можно логически вывести, какова последовательность оснований в данном фрагменте ДНК: сначала идет Ц, затем еще Ц, затем Г и так далее.
В 1980 году Фред Сенгер получил Нобелевскую премию по химии совместно с Уолли Гилбертом и Полом Бергом, награжденным за вклад в разработку технологий, связанных с рекомбинантной ДНК (необъяснимо, почему такой чести не были удостоены ни Стэнли Коэн, ни
Для Сенгера это была вторая по счету Нобелевская премия [9] . В 1958 году он получил премию по химии за изобретение метода секвенирования белков – он научился определять последовательность аминокислот в белковой молекуле и таким способом выяснил состав человеческого инсулина. Однако сенгеровские методы секвенирования белков и ДНК совершенно не связаны ни в техническом, ни в идейном отношении. Каждый из методов он разработал с нуля, и, пожалуй, Сенгер заслуживает звания величайшего технического гения в ранней истории молекулярной биологии.
9
Фред Сенгер – один из немногих дважды лауреатов Нобелевской премии, и компания у него самая изысканная. Мария Кюри получила премию сначала по физике (1903), а затем по химии (1911). Джон Бардин был дважды удостоен премии по физике: сначала за открытие транзисторов (1956), а затем за исследования сверхпроводимости (1972). Лайнус Полинг в 1954 году получил премию по химии, а в 1962 году – премию мира.
Фред Сенгер, умерший в 2013 году, не походил на «типичного» дважды нобелевского лауреата. Он родился в квакерской семье, стал социалистом, а в годы Второй мировой войны отказался от военной службы по религиозным убеждениям. Еще невероятнее, что он нигде не распространялся о своих достижениях, а нобелевские регалии также не хранил на виду. «Получаете красивую золотую медаль и относите ее на хранение в банк. Есть еще сертификат, я храню его на чердаке». Он даже отказался от рыцарского титула: «Рыцарство выделяет вас среди окружающих. А я не хочу выделяться». После ухода на покой Сенгер с удовольствием садовничал у себя дома близ Кембриджа, хотя иногда и посещал Сенгеровский центр (ныне называется «Институт Сенгера») – геномную лабораторию в Кембридже, открытую в 1993 году.
Метод секвенирования ДНК, предложенный Сенгером
Секвенирование подтвердило одно из наиболее замечательных открытий 1970-х годов. Уже было известно, что гены – это линейные цепочки, состоящие из оснований А, Т, Г и Ц, и что эти основания транслируются тройками, в соответствии с генетическим кодом. Из них собираются линейные цепочки аминокислот – такие молекулы называются «белками». Однако замечательные исследования, проведенные Ричардом Робертсом, Филом Шарпом и другими, показали, что у многих организмов гены образуют прерывистые участки и жизненно важные отрезки ДНК перемежаются с нерелевантными. Только после транскрипции матричной РНК эта путаница рассортировывается в процессе «редактирования», при котором ненужные участки удаляются. Это равноценно тому, как если бы в этой книге случайным образом встречались лишние абзацы, с виду перемешанные как попало, и в них рассказывалось бы то о бейсболе, то об истории Римской империи. Уолли Гилберт назвал такие вставные последовательности «интронами», а те участки, которые отвечают, собственно, за кодирование белков (то есть образующие функциональную часть гена), – «экзонами». Оказывается, что интроны встречаются в ДНК сравнительно сложноорганизованных существ; у бактерий их нет.
Интроны и экзоны. Некодирующие интроны вырезаются из матричной РНК перед синтезом белков
Некоторые гены особенно богаты интронами. Например, у человека есть ген фактора свертываемости крови VIII (он может мутировать у людей, страдающих гемофилией), который содержит двадцать пять интронов. Фактор VIII – большой белок, его длина составляет около двух тысяч аминокислот, но на кодирующие экзоны в нем приходится всего около 4 % общей длины гена. Оставшиеся 96 % – это интроны.
Каков функционал интронов? Ведь очевидно, что их наличие радикально усложняет все клеточные процессы, поскольку при формировании матричной РНК их всегда требуется вырезать, а это сложное дело, особенно с учетом того, что единственной ошибки при вырезании интрона при подготовке матричной РНК достаточно, чтобы, допустим, фактор свертываемости крови VIII приобрел мутацию сдвига рамки, которая «испортит» весь белок. Существует теория, что такие молекулярные вкрапления – попросту эволюционный рудимент, наследие, сохранившееся со времен зарождения жизни на Земле. Однако до сих пор активно обсуждается, как могли возникнуть интроны и есть ли от них какая-либо польза в великом коде жизни.