Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №5
Шрифт:
После пересадки мицелия с агара на зерно, можно переходить от этих зерновых культур к получению большего количества банок с грибницей. Серия переносов мицелия начиная с мастер-банок, помеченных как G-1, через ещё два «поколения» банок (G-2 и G-3, соответственно), позволяет добиться экспоненциального наращивания массы мицелия. К примеру, если с агаровой культуры было инокулировано 10 банок (G-1), в дальнейшем с их помощью можно произвести инокуляцию ещё 100 банок (G-2), которые в свою очередь дают ещё 1000 банок (G-3). Совершенно очевидно, что чистота первой партии банок должна быть безупречной, т. к. в конечном счете, с её помощью будет проинокулировано ещё 1000 банок! Не рекомендуется продолжать инокуляции за пределы третьего поколения. На самом деле если уровень потерь по причине
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ НОСИТЕЛИ ГРИБНИЦЫ
Некоторые виды грибов на зерне растут не очень хорошо и им больше подойдут альтернативные носители грибницы. Другие грибы не растут на зерне вовсе. К примеру такие обитающие на деревьях грибы как Lentinus edodes и Flammulina velutipes предпочитают опилки и отруби в качестве субстрата. Ещё один вид носителя состоит из отрубей и перлита. Перлит это стекловидный камень разогретый свыше 500 °C и взорванный как попкорн. Тонкие хлопья отрубей легко стерилизуются, в то время как перлит создаёт структуру смеси. Рецепты приготовления следующие:
ГРИБНИЦА НА ОПИЛКАХ С ОТРУБЯМИ
4 части опилок (твёрдых пород)
1 часть отрубей (рисовых или пшеничных)
Замочите опилки в воде как минимум на двадцать четыре часа. Дайте стечь воде затем тщательно смешайте с отрубями. Если смесь обладает правильным уровнем влажности, то при сжатии в кулаке выделится только несколько капель воды. Плотно наполните доверху контейнер (с широким горлом) субстратом. Японские производители грибницы делают в субстрате по центру отверстие до дна, которое впоследствии заполняют инокуляционным материалом. Стерилизуйте 60–90 минут при 1,05 атм (15 psi). После остывания инокулируйте агаром, жидкой эмульсией или зерном. Полностью колонизированная ёмкость с грибницей на опилках с отрубями может быть также использована для дальнейших инокуляций.
ГРИБНИЦА НА ПЕРЛИТЕ
120 миллилитров воды
4 0 грамм перлита
50 грамм пшеничных отрубей
6 грамм гипса (сульфат кальция)
1,5 грамм карбоната кальция
Просейте перлит чтобы удалить из него пыль и мелкий мусор. Наполните контейнер (с узким горлом) сухими ингредиентами и хорошо смешайте. Добавьте воду и продолжайте перемешивать пока ингредиенты не увлажняться полностью. Стерилизуйте час при 1,05 атм (15 psi). Инокулируйте агаром или жидкой эмульсией.
МЕТОДЫ ИНОКУЛЯЦИИ ЖИДКОСТЬЮ
Способ инокуляции зерна взвесью измельчённого грибного мицелия в стерильной воде обладает высокой эффективностью. Эта насыщенная мицелием смесь содержащая сотни коротких клеточных цепочек впрыскивается в банку со стерильным зерном. По мере того как эта жидкость просачивается через зерно, каждый из равномерно распределённых фрагментов мицелия становится точкой инокуляции. В течении нескольких дней видимые признаки роста могут не появиться или рост будет слабым. На четвёртый или пятый день после впрыскивания при сохранении оптимальной температуры станут заметными места активного роста мицелия. В течении буквально часов эти участки увеличатся и вскоре зерно будет поглощено мицелием. Способ жидкой инокуляции позволяет избежать частого перетряхивания банок и использовать одну чашку Петри для инокуляции до 100 банок,
Первый способ достаточно прост. Используя стерильный шприц впрысните 30–50 мл стерильной воды в чашку со здоровой культурой. Затем поскребите иглой по поверхности мицелия и втяните в шприц как можно больше его фрагментов. Всего 5 мл полученной жидкости достаточно для инокуляции литровой банки с зерном.
Второй способ включает использование блендера со специальной автоклавируемой насадкой-ёмкостью для размешивания. (Несколько компаний производят специальные ёмкости из алюминия и нержавеющей стали приспособленные для работы с жидкой культурой — см. Приложение к данной книге). Её надо наполнить водой на две трети или три четверти, накрыть алюминиевой фольгой, стерилизовать и дать остыть до комнатной температуры.
В асептических условиях поместите в неё плотно поросшую мицелием пластинку агара разрезав её на четыре дольки или на тонкие полоски. Поскольку большинство контаминантов сосредоточено по внешнему периметру чашки, не рекомендуется использовать эти области. Положите все дольки или полоски в жидкость. Включите блендер на максимальной скорости не более чем на 5 секунд. (Более продолжительное перемешивание приведёт к разрушению не только клеточных цепочек, но и к повреждению самих клеток. Такая взвесь окажется непригодной). Наберите в стерильный шприц 5-10 мл концентрата мицелия и инокулируйте готовую банку с зерном.
Дальнейшее совершенствование этого способа предполагает разведение концентрированной взвеси в соотношении 1:10. Введите по 50 мл концентрата в сосуды содержащие по 450 мл стерильной воды. Для этого хорошо подойдут стеклянные банки с узким горлом объёмом около литра. Мягко встряхните каждую банку для равномерного распределения мицелия. После этого можно инокулировать банки с зерном используя по 10–15 миллилитров раствора на каждую. В результате использования этого метода вы получаете экспоненциальное увеличения объёма инокуляционного материала с помощью воды, которая является носителем который доставит частицы мицелия глубоко в банки наполненные зерном. Это пока единственная технология использующая взвесь мицелия в воде для инокуляции. Нет сомнений что со временем появятся дальнейшие улучшения благодаря микофилам, которые в ходе собственных экспериментов разработают свои технологии.
При использовании металлических крышек для банок в них можно сделать отверстия диаметром 1–2 мм и заклеить их липкой лентой или пластырем. Перед инокуляцией стерильных контейнеров откройте отверстие, введите а него иглу шприца, впрысните в него взвесь и верните пластырь на место. При использования такого способа инокуляции шанс проникновения воздушной инфекции за одну или две секунды в такой маленький зазор минимален.
Метод жидкой инокуляции отлично работает при условии, что исходная культура чиста и свободна от посторонних спор; в противном случае вся партия проинокулированная из этой чашки будет потеряна. Недостаток тут кроется в том, что в воду попадают как нужный мицелий так и споры контаминантов и если бы при традиционном способе инокуляции заражению подверглись бы только несколько банок, то в случае с жидкой инокуляцией до сотни банок с субстратом могут стать непригодными.
Хотя взвесь большинства видов грибов полученная таким способом пригодна для инокуляции, мицелий некоторых грибов не выдерживает перемешивания в блендере.
ИНКУБАЦИЯ ГРИБНИЦЫ
С каждым последующим шагом процесса разведения нарастает масса мицелия и соответственно субстрата. Через неделю-две после инокуляции банки с носителем должны быть полностью колонизированы грибным мицелием. Опасность здесь заключается в том, что если инфекция останется незамеченной, то плесень или бактерии будут воспроизведены в больших количествах. Следовательно со временем чистота мастер-банок становится первостепенной. Правильный баланс параметров среды, особенно температуры, создаёт благоприятные условия для развития именно грибного мицелия.