Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Партасарати Рагувир

Концепция нанопорового секвенирования проста, и еще в 1980-х в ней читались задатки перспективной технологии. Ее реализация, однако, потребовала немалых усилий. Сначала ученые показали надежность внедрения нанопор в искусственные барьеры – тогда еще не с целью секвенирования, а просто для понимания структуры пор и разработки платформ, позволяющих работать с мембранно-белковыми комплексами. Первые опыты по переносу ДНК через поры с помощью электрического поля помогли разобраться в физике движения в ограниченных пространствах. Хотя к началу 2000-х специалисты уже располагали основными принципами, многим сторонним наблюдателям, включая меня, было сложно разглядеть в нанопоровом секвенировании мощную и надежную технологию будущего. Необходимо было искусно скомпоновать поры, ДНК-связывающие белки, мембраны в несколько нанометров толщиной и электроды. Затем нужно было отработать высокочувствительные измерения силы тока и исключить при этом закупорку пор примесями или поврежденными белками. Эту пугающую инженерную задачу взвалила на

себя компания Oxford Nanopore, которая занимается, как можно догадаться, в основном нанопоровой детекцией молекул. Первый прибор ученым представили в 2014 году – это была пилотная версия для оценки эффективности метода, – а теперь на рынке мы можем выбирать уже из нескольких разных аппаратов. Самый маленький сравним по размеру с большим пальцем или флешкой и, прямо как она, подключается к компьютеру через USB-порт. Привлекательность прибора во многом объясняется портативностью и низкой стоимостью. Например, в 2014-м с его помощью секвенировали геном эболавирусов, выделенных из 14 гвинейских пациентов. Его картировали уже через два дня после взятия проб, блестяще продемонстрировав потенциал скоростного секвенирования в полевых условиях. Эта технология позволяет оперативно выявлять источник распространения болезни и потенциально опасные варианты патогенов.

Недостаток нанопорового секвенирования в его не самой высокой точности: несколько процентов оснований может читаться некорректно, при том что метод Illumina допускает лишь около 0,1 % ошибок. Величина погрешности, правда, важна не всегда. При составлении подробной карты генома и в пренатальных анализах на точечные, но значимые мутации нам критически важно сводить число ошибок к минимуму. В мониторинге потенциально опасных патогенов и состава микробных сообществ сниженная точность метода вполне компенсируется его быстротой и удобством [56] .

56

В последних разработках Oxford Nanopore точность чтения, похоже, приблизилась к показателям Illumina (см., например, доклад А. М. Ермакова, эксперта по нанопоровому секвенированию из ИТЭБ РАН: https://www.youtube.com/watch?v=xiOm0– yyCm4). При этом нанопоровое секвенирование обеспечивает недостижимую для других технологий длину прочтений – сотни тысяч оснований и даже больше (здесь многое зависит от этапа выделения ДНК): это сильно облегчает сборку целых геномных последовательностей по сравнению с тем же Illumina. К тому же этот метод обычно обходится без амплификаций и модификаций ДНК и спокойно относится к сериям одинаковых нуклеотидов.

Геном дешевеет и дешевеет

Прорывы в секвенировании ДНК оказались поразительными, и от будущего, вероятно, следует ожидать еще большего. Я уже упоминал рыночную стоимость этих технологий, а теперь давайте посмотрим, во что ученым обходится определение нуклеотидной последовательности образца ДНК. Удобной мерой будет стоимость секвенирования одного человеческого генома – иными словами, 3 миллиардов оснований. Как вы помните, на первый геном ушло 3 миллиарда долларов США, по доллару на основание. Уже к 2006 году затраты снизились больше чем на 99 % – примерно до 13 миллионов долларов. График изменения стоимости секвенирования во времени просто изумляет.

Стоимость секвенирования одного человеческого генома

Вертикальная ось на этом графике логарифмическая, горизонтальная – обычная. Стоимость секвенирования снижается быстро и непрерывно¹³. Обвал 2007–2008 годов – удешевление в тысячу раз за полдесятилетия – знаменует переход к методам секвенирования нового поколения. Вместе со стоимостью стремительно сокращается продолжительность секвенирования одного генома – с нескольких лет в проекте «Геном человека» до нескольких дней при использовании современных техник.

С похожей скоростью, пожалуй, развивались технологии производства транзисторов. Первые транзисторы были капризными и громоздкими, миллиметрового масштаба. Теперь мы без труда помещаем миллиарды транзисторов на чипы площадью в квадратный сантиметр и стоимостью несколько долларов за штуку. В 1965 году Гордон Мур, впоследствии возглавивший компанию Intel, заметил, что количество транзисторов на чипе удваивается каждый год (позже он скорректировал оценку с года на два). Это наблюдение вошло в историю под названием «закон Мура» и служило одновременно описанием и манифестом электронных технологий. Прогресс в секвенировании ДНК, по крайней мере измеряемый затратами на чтение одного нуклеотида, был даже более стремительным. Неудивительно, что первым человеком, геном которого секвенировали с помощью Personal Genome Machine компании Ion Torrent, стал именно Гордон Мур. Революцию в технологиях секвенирования породило множество факторов: человеческая изобретательность, экономические стимулы компаний-производителей, государственное финансирование теоретических исследований и спецпрограмм, нацеленных на инновации в области секвенирования¹⁴, ну и, конечно, накопленные нами знания по биологии, химии и физике.

Когда секвенатор ДНК не соответствует своему названию?

Последовательности ДНК сообщают нам немало информации: например, как на генетическом уровне различаются виды, особи одного вида, раковые и нормальные клетки. Тем не менее главной миссией технологий секвенирования может оказаться вовсе не чтение генов и геномов, а помощь в постижении внутренней жизни клеток.

Рассмотрим для примера РНК. В первой части книги мы говорили, что чтение генов обеспечивает фермент РНК-полимераза: она транскрибирует последовательность ДНК в последовательность РНК, которая затем может транслироваться в цепочку из аминокислот – белок. Не считая яйцеклеток, сперматозоидов и некоторых иммуноцитов, все клетки вашего организма имеют одинаковый геном, поэтому секвенировать ДНК каждой клетки было бы избыточным. Зато интересно было бы знать, какие молекулы РНК синтезируются в каждой клетке: так мы могли бы понять, какие гены включаются и выключаются, когда клетки в ходе развития становятся кровяными тельцами или нейронами либо когда реагируют на изменения в питании или на стресс. Для этого нам необходимо секвенировать молекулы РНК, четко зная, из какой клетки они получены. Вы уже, наверное, представляете характерные черты нашей методологии: мы используем физические силы и свойства, дополняя их биологическими инструментами, разработанными природой.

На этот раз вместо медуз и светлячков нашими помощниками станут вирусы. Центральная догма молекулярной биологии гласит, что ДНК кодирует РНК, которая кодирует белки. Когда в 1970-м исследовательские группы Дэвида Балтимора и Говарда Темина независимо друг от друга открыли способность некоторых вирусов обращать этот процесс вспять – транскрибировать свой РНК-геном в ДНК, которая еще и внедряется в геном клетки-хозяина, – эта новость многих потрясла. Вирусный белок, производящий, по сути, обратную транскрипцию, назвали соответственно – обратной транскриптазой (ревертазой)¹⁵. Теперь мы умеем использовать ее в своих целях, как обычную ДНК-полимеразу и другие подобные инструменты.

Выделив РНК из клетки, мы можем добавить к ней обратную транскриптазу и свободные нуклеотиды, чтобы синтезировать ДНК, комплементарные однонитевым РНК. Например, в случае РНК-последовательности ЦAГУУГГA мы получим ДНК-комплемент ГTЦAAЦЦT (как вы помните из главы 3, У в РНК заменяет T в ДНК). С помощью секвенирования мы узнаем точную нуклеотидную последовательность этой комплементарной ДНК (кДНК), а значит, и исходной РНК. Чтобы изучить полный набор РНК (транскриптом) отдельной клетки, ученые применяют методы вроде тех, что мы уже рассматривали: например, изолируют одиночные клетки с шариками и необходимыми ингредиентами в каплях водно-масляной эмульсии¹⁶. Каждая молекула РНК транскрибируется в ДНК, которая затем секвенируется – и вот мы уже знаем, какие гены были «включены» в той или иной клетке.

Хотя секвенирование транскриптома одиночных клеток и предполагает их разрушение, они служат типичными представителями той или иной клеточной популяции, траекторию развития которой можно проследить, отбирая из нее такие вот жертвенные единицы на разных этапах какого-то процесса либо после специфического воздействия. Так ученые исследовали, например, ответные изменения экспрессии генов у иммуноцитов организмов, вступивших либо не вступивших в контакт с интересующим патогенным стимулом. Или вот другой пример: по РНК, выделяемой из эмбрионов данио-рерио и мышей на разных этапах после зачатия, можно отслеживать динамику профилей экспрессии генов, направляющую клетку по тому или иному пути специализации.

Секвенирование РНК – одна из множества технологий, опирающихся на секвенирование ДНК [57] . Сегодня ученые уже умеют определять, какие сегменты ДНК намотаны на гистоны, к каким нуклеотидам прикреплены метильные группы, какие участки генома покрыты факторами транскрипции и многое другое. В заголовке мы спросили: «Когда секвенатор ДНК не соответствует своему названию?» И каков же ответ? Когда он секвенирует РНК, или когда картирует элементы упаковки ДНК, или когда исследует регуляцию работы генов, да вообще много когда.

57

Некоторые секвенаторы – в частности, нанопоровые варианты – умеют секвенировать РНК напрямую, минуя этап синтеза кДНК, правда, теряя в производительности.