Биохимия старения

Канунго М. С.

Гистон Н5 также подвержен фосфорилированию. В эритроцитах птиц гистон Н5 фосфорилируется вскоре после его синтеза и затем дефосфорилируется по мере созревания клетки [335]. В отличие от других гистонов гистон Н5 дефосфорилируется в период инактивации генома и конденсации хромосом. Фосфорилированный гистон Н5 не так эффективно вызывает изменение конформации ДНК, как его дефосфорилированная форма. Фосфорилированные остатки (серии) обнаруживаются в областях гистона Н5, имеющих сильноосновный характер и связанных с ДНК. 50 % фосфатов находится в области 1-28, а остальные — на участке 100–200. В процессе сперматогенеза у некоторых видов млекопитающих протамины претерпевают фосфорилирование — дефосфорилирование, что, по-видимому, необходимо для упаковки ДНК [242].

Фосфорилирование НГБ

НГБ фосфорилированы в высокой степени и содержат как P-O-, так и P-N-связи. Полагают, что их фофорилирование катализируют киназы, отличные от тех, которые катализируют фосфорилирование гистонов. Существенным для фосфорилирования является содержание протеинкиназ и сАМР [180]. Кальцитонин стимулирует фосфорилирование НГБ костных клеток в культуре, особенно белков с малой молекулярной

массой (10000-45000), но подавляет фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Вместе с тем гормон паращитовидной железы стимулирует фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Таким образом, два пептидных гормона, противоположным образом влияющие на метаболизм кальция, могут реализовать свое действие с помощью фосфорилированных НГБ. Стероидные гормоны также индуцируют фосфорилирование НГБ [88, 183].

Фосфорилирование НГБ зависит от типа клеток и их физиологического состояния [191]. Скорость этого процесса в синхронизированных клетках HeLa in vitro меняется, причем самая большая скорость наблюдается в фазах G₁ и S. Когда покоящиеся клетки LC начинают быстро размножаться, одним из самых ранних событий является фосфорилирование НГБ. При добавлении к ядрам клеток печени крыс полиаминов, спермина и спермидина активность протеинкиназы ядер повышается в 2–3 раза, а скорость фосфорилирования НГБ — во много раз [115]. У Physarlum полиамины стимулируют фосфорилирование нескольких уникальных НГБ [19].

В отличие от фосфорилированных гистонов, которые влияют на структуру хроматина, фосфорилированные НГБ участвуют в экспрессии генов [284, 306, 332, 351]. Фосфорилированные НГБ клеток HeLa в фазе G₁ стимулируют транскрипцию генов гистона в фазе G₁, хотя в данной фазе эти гены не активны. Фосфорилированные НГБ усиливают транскрипцию, а дефосфорилированные уменьшают ее [85, 270]. Механизм этого воздействия, вероятно, заключается в непосредственном взаимодействии белков с ДНК. Такой вывод вытекает из следующих наблюдений: НГБ обладают различной способностью к фосфорилированию, способ их фосфорилирования зависит от типа ткани; при изменениях в их фосфорилировании изменяются структура хроматина и активность генов, а фосфорилированные НГБ специфически связываются с ДНК. НГБ клеток карциномы молочной железы в стадии зависимого от гормона роста и во время регрессии фосфорилируются по-разному [83]. Когда хроматин фибробластов W1-38 человека реконструируют из ДНК и нефосфорилированных или фосфорилированных НГБ, в последнем случае степень транскрипции много больше [295].

Ацетилирование

Есть сообщение о наличии у гистонов ацетильных групп [288]. Ацетилирование гистонов в изолированных ядрах впервые было описано Олфри с сотрудниками [13]. В гистонах обнаружены ацетилированные аминокислотные остатки двух типов: а) NH2-концевой серии гистонов Н1, Н2А и Н4 ацетилируется в N-ацетилсерин; это необратимая постсинтетическая модификация, катализируемая ферментом, содержащимся в цитозоле; б) ацетилированные внутренние лизиновые остатки образуются в результате постсинтетической реакции, протекающей в цитозоле [308] и в ядре после того, как гистоны переходят из цитозоля в ядро и связываются с ДНК [65]. Ацетилирование внутренних остатков в гистоне Н1 либо незначительно, либо вообще отсутствует. Ацетилируется один центр в гистоне Н2А и по четыре центра в каждом из гистонов Н2В, Н3 и Н4. Ацетилирование лизиновых остатков катализируется ацетилтрансферазой, являющейся компонентом НГБ.
– NH₂– группы внутренних лизиновых остатков, расположенных на NH₂– концах половины гистонов, ацетилируются с образованием -N-ацетиллизина [11, 101, 130], причем в одной молекуле может содержаться до четырех ацетильных групп. Это энергозависимая реакция, в которой источником ацетильной группы является ацетил-CoA. Деацетилирование катализируется деацетилазой, которая также присутствует в хроматине. Схема реакции приведена ниже:

Ацетилируются внутренние лизиновые остатки 9, 14, 18 и 23 гистона Н3 и 5, 8, 12 и 16 гистона Н4 [67, 99]. Эти остатки расположены в NH₂– концевой области полипептидной цепи, которая является сильно основной и взаимодействует с кислотными группами ДНК. Ацетилированные гистоны связываются с ДНК менее эффективно, чем деацетилированные [6]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков — процесс обратимый и происходит весьма быстро при самых разных условиях. Период полупревращения реакции ацетилирования очень мал и составляет всего около 3 мин [172, 267]. Были изолированы две гистон-ацетилтрансферазы, имеющие различные оптимумы рН. Ацетилирование ингибируется ионами Mn²⁺. Этот факт представляется важным, поскольку двухвалентные катионы необходимы для функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы. сАМР, влияющая на фосфорилирование, не действует на ацетилирование [33]. Максимальная скорость ацетилирования достигается в интерфазе, по мере вхождения клеток в митоз она уменьшается. Минимальная скорость реакции наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы в наибольшей степени конденсированы [95]. По мере того как клетки входят в телофазу и хромосомы увеличиваются в размере, скорость ацетилирования гистона Н4 увеличивается. Минимальный синтез РНК наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы сильно конденсированы. Важно, что ацетилирование гистона Н4 также минимально именно в этих двух фазах клеточного цикла [33]. Ацетилирование гистонов Н3 и Н4 в эритробластах птиц уменьшается по мере их превращения в зрелые эритроциты, в которых хроматин сильно конденсирован и неактивен ни в транскрипции, ни в репликации [309]. Таким образом, деацетилирование гистонов коррелирует с ингибированием транскрипции, и наоборот, ацетилирование стимулирует транскрипцию. Так как при ацетилировании нуклеосомных гистонов уменьшается их положительный заряд, они могут отделяться от ДНК, благодаря чему ДНК делается доступной для транскрипции.

Если хроматин депротеинизируется, то его транскрипция усиливается [167]. Показано, что при стимуляции синтеза РНК в лимфоцитах митогенами [289], в тканях-мишенях — гормонами [228] и в печени — после частичной гепатэктомии [290] сначала происходит ацетилирование гистонов. В результате ацетилирования нуклеосомных гистонов усиливается транскрипция хроматина тимуса теленка [241]. Если гистоны Н2А и Н2В добавить к ДНК, лишенной хроматина, то транскрипция подавляется. Однако если эти два гистона затем ацетилируются, то репрессия прекращается. При ацетилировании гистонов Н3 и Н4 также наблюдается стимуляция транскрипции. Показано, что ацетилирование предшествует увеличению синтеза РНК [308]. Ацетилирование гистонов происходит не только в делящихся, но и в неделящихся клетках, в которых значительная часть хроматина неактивна в отношении транскрипции [66]. Ацетилирование гистонов стимулирует удлинение цепей при транскрипции [241]. Возможно, что транскрипция генов, которые специфически "включаются" эффекторами, контролируется степенью ацетилирования гистонов и (или) НГБ.

Приведенные выше заключения подтверждаются следующими фактами. Транскрипционно неактивный гетерохроматин инфузорий имеет низкую степень ацетилирования, тогда как эухроматин транскрипционно активен и сильно ацетилирован [232]. Транскрипционно активные макроядра Tetrahymena pyriformis содержат ацетилированные гистоны, тогда как в репрессированных микроядрах их нет [136]. Активные материнские хромосомы червеца содержат значительно больше ацетильных групп, чем неактивные отцовские хромосомы [34]. В исследованиях, выполненных на клетках Drosophila в культуре [227], показано, что ¹⁴С-ацетат включается главным образом в гистоны Н3, Н4 и Н2В, а ³²Р-фосфат — в гистоны Н1, Н3 и Н4. Самое высокое содержание как ¹⁴С-ацетата, так и ³²Р наблюдается в гистоне Н3. Когда матрично активные и матрично неактивные области хроматина разделяли после его переваривания ДНКазой II, было обнаружено, что первые содержат большее количество обеих меток (¹⁴С и ³²Р). Эти данные подтверждают предположение, что различия между транскрибируемыми и нетранскрибируемыми областями хроматина отчасти объясняются специфическими модификациями гистонов в определенных локусах.

Степень ацетилирования гистонов из клеток семенника форели изучали путем инкубирования их с ¹⁴С-ацетатом [96]. Гистоны Н2А, Н2В и Н3 ацетилируются в одном положении, в то время как гистон Н4 — в одном, двух, трех и четырех положениях. Когда нуклеосомы, полученные после ацетилирования, обрабатывали трипсином, при этом удаляли NH₂– концевые области четырех гистонов, содержащие лизиновые остатки и связанные с ДНК. Эти лизиновые остатки как раз и были ацетилированы. Если нуклеосомы затем расщепляли нуклеазой, то освобождались фрагменты ДНК, обычно при наличии NH₂– концевых областей устойчивые к нуклеазе [368]. Ацетилирование приводит к увеличению скорости расщепления хроматина ДНКазой I [268, 362]. Хроматин, содержащий высокоацетилированные гистоны, легче расщепляется ДНКазой I, но не микрококковой нуклеазой [244]. Когда хроматин из семенника форели гидролизовали ДНКазой II, получали транскрипционно активную фракцию, содержащую высокоацетилированный гистон Н4 [97]. Гистоны Н3 и Н4 клеток HeLa сильно ацетилируются при выращивании в бутирате. Нуклеосомная ДНК таких клеток гидролизуется ДНКазой I в 5-10 раз быстрее. При этом ДНК специфически расщепляется в сайте, где в нормальных условиях разрыва не происходит [324]. Показано также [268, 315, 316], что ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК в тех областях хроматина, которые сильно ацетилированы. По-видимому, нуклеосомы в этих областях после ацетилирования подвергаются конформационным изменениям. Поскольку такие изменения необходимы для того, чтобы РНК- и ДНК-полимеразы могли использовать ДНК в качестве матрицы, не исключено, что ацетилирование представляет собой один из. способов, с помощью которого гистоны частично отделяются от ДНК, благодаря чему последняя становится доступной для ферментов. Таким образом, ацетилирование важно как для функционирования хроматина, так и для его структуры и конформации. Высказано предположение, что гистон Н4 связывается с ДНК по механизму, на первых стадиях которого происходит ацетилирование [236]. Затем может произойти деацетилирование, приводящее к электростатическим взаимодействиям, в результате которых закрепляется конформация. В сперматиде морского ежа, не синтезирующей РНК, гистон Н4 полностью деацетилирован, тогда как в эмбрионе, где наблюдается высокая активность генов, он ацетилирован [53]. Таким образом, между ацетилированием гистона Н4 и активностью хроматина наблюдается прямая корреляция.

Изучению роли ацетилирования гистонов в функционировании хроматина способствовало обнаружение того факта, что в присутствии бутирата эта модификация усиливается и гистоны Н3 и Н4 специфически гиперацетилируются [68, 302, 315], так как бутират ингибирует гистон-деацетилазу. Бутират ингибирует предпочтительно эндогенную деацетилазу гистонов Н3 и Н4 [287], и при этом он не влияет на скорость ацетилирования [41, 68, 300]. По-видимому, гистон-деацетилаза может играть важную роль в метаболическом контроле ацетилирования. При гиперацетилировании гистонов связанная с ними ДНК в клетках HeLa становится более доступной для ДНКазы I, но не для стафилококковой нуклеазы. ДНКаза I способствует также удалению из комплекса гистонов Н3 и Н4 [359]. Одновременно подавляется синтез ДНК [146]. Можно предположить, что ацетилирование гистонов специфически необходимо для транскрипции и не нужно для репликации. В отличие от фосфорилирования, которое характерно для гистона Н1 и только делящихся клеток, ацеталирование протекает главным образом в гистонах Н3 и Н4 и в делящихся, а также неделящихся клетках, которые метаболически активны. Это подтверждает предположение, согласно которому ацетилирование нуклеосомных гистонов играет важную роль в транскрипции. Об ацетилировании НГБ известно очень мало; в одной из работ сообщается, что ацетилируются белки HMG из ядер тимуса теленка и эритроцитов утки [333].