Биохимия старения

Канунго М. С.

Подобные изменения в транскрипционной активности хроматина происходят на стадии эмбриогенеза у амфибий [102] и морских ежей [118]. Качественные изменения наблюдаются и при индуцированной гормонами дифференцировке молочной железы [355]. Механизм, с помощью которого осуществляется дифференциальная экспрессия генов, неизвестен. Вопрос заключается в том, возникают ли изменения в хроматине — структурные и функциональные — после достижения зрелости и ведут ли эти изменения к старению организма. Для того чтобы найти ответ на эти вопросы, многие исследователи изучали разные свойства хроматина в зависимости от возраста.

В ряде работ измеряли температуру плавления (T_m) хроматина из печени и тимуса, и во всех случаях было обнаружено в старческом возрасте увеличение T_m [31,32, 149,208, 274, 296]. С помощью ЭВМ был изучен профиль температуры плавления хроматина; было обнаружено, что гиперхромизм и T_m в старости увеличиваются [297]. Это может объясняться увеличением с возрастом числа ковалентных связей между хромосомными белками и ДНК [147–150]. Данная точка зрения согласуется с тем, что количество белка, которое можно экстрагировать из хроматина с помощью солевого раствора, с возрастом уменьшается [274], а количество одноцепочечных разрывов в ДНК увеличивается [80], так как включение ³Н-тимидина в ДНК с возрастом увеличивается [143, 294, 311]. Показано, что ДНК печени старой мыши (20 мес) более чувствительна к S₁– нуклеазе, чем ДНК мыши в возрасте от 1 до 15 мес [81]. При седиментации ДНК из мозга мыши в градиенте щелочной сахарозы образуются четыре полосы для старых животных и одна для молодых, что свидетельствует о деградации ДНК в старческом возрасте в результате одноцепочечных разрывов. Такие разрывы в ДНК могут обеспечивать центры для ее ковалентного связывания с хромосомными белками. Одним из факторов, который, по-видимому, способствует образованию разрывов, является диметилирование цитозина. Сообщается, что небольшая доля (3- 10 %) цитозина ДНК постсинтетически метилируется с образованием 5-метилцитозина [54, 322]. Эта модификация предохраняет данный сайт ДНК от расщепления ферментом рестрикции [37, 128, 304], в частности ферментом Нра II [240, 323]. В результате деметилирования цитозинов эти сайты могут стать восприимчивыми к расщеплению, что приведет к увеличению числа разрывов в ДНК. Известно, что содержание 5-метилцитозина в печени рыб с возрастом уменьшается [358]. Однако показано, что метилирование ДНК, выделенной из полушарий головного мозга крыс, в старости увеличивается [348]. Это может усиливать связь ДНК с гистонами и не только увеличивать T_m хроматина, но и уменьшать его матричную активность. Стабильны ли метильные группы ДНК — неизвестно, но весьма вероятно, что метилирование ДНК осуществляется ферментами, отличными от тех, которые метилируют гистоны.

Изучение гибридизации ДНК — РНК в печени мышей показало, что доля ДНК, которая гибридизуется с уникальными и повторяющимися последовательностями РНК, с возрастом уменьшается [92]. Как отсюда следует, с возрастом уменьшается доля транскрибируемой ДНК, что в свою очередь указывает на увеличение связывания и маскировки ДНК хромосомными белками. С помощью того же метода измерялось число транскрибированных рибосомных генов на гаплоидный геном мыши [126, 127]. В возрасте более 2 лет наблюдалось резкое уменьшение числа транскрибированных генов. Однако у человека подобные изменения не обнаруживаются. Аналогичные методы использовались для количественной оценки процентного содержания транскрибированной сателлитной ДНК в различных тканях мыши [291]. В селезенке, почках и в мозгу изменений не наблюдалось, но в печени с возрастом ее количество увеличивалось.

Несколько исследователей изучали транскрипцию РНК на хроматине в зависимости от возраста. В экспериментах in vitro с использованием срезов печени и мозга было показано, что синтез РНК в этих тканях в старческом возрасте уменьшается [103, 145]. Причиной этого может являться уменьшение количества РНК-полимеразы [51, 239]. Обнаружено, что транскрипционная активность различных тканей в старости уменьшается [274, 296]. Результаты, полученные в опытах in vivo, свидетельствуют о том, что синтез РНК в печени, мозгу, сердце и селезенке крыс в старческом возрасте понижается [181]. С возрастом претерпевают качественные изменения типы синтезируемых РНК, а отношение РНК: белок уменьшается [92]. РНК некоторых типов, синтезируемые в организме в среднем возрасте, в старости исчезают, и появляются молекулы новых типов, которые не синтезируются в репродуктивном периоде. Это напоминает возрастные изменения в наборе изоферментов, например аланинаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы (гл. 3).

Содержание гистонов в клетке каждой ткани остается приблизительно постоянным на протяжении всей жизни [71]. В нуклеосомных гистонах печени и селезенки крыс и мышей количественных и качественных изменений не происходит, но изменяются три субфракции гистона Н1 [248, 249]. Так, в старческом возрасте специфически увеличивается количество субфракции гистона Н1, содержащей метионин. Предстоит выяснить, как это влияет на структуру и функции хроматина. Сообщается, что содержание НГБ и РНК в хроматине крыс с возрастом уменьшается [104, 207].

Хотя гистонов всего несколько и они играют структурную роль, изменения в степени их ассоциации с ДНК могут иметь значение как при транскрипции, так и при репликации. Благодаря различным ковалентным модификациям их ассоциация с ДНК может меняться. Канунго и его сотрудники исследовали in vitro зависимость ковалентных модификаций гистонов от возраста и модуляции этих модификаций различными эндогенными факторами. В опытах использовали срезы коры головного мозга крыс разного возраста. Схема этих исследований показала на рис. 2.5. Было обнаружено, что фосфорилирование гистонов полушарий большого мозга с возрастом уменьшается [182]. В частности, резко уменьшается фосфорилирование гистонов Н1 и Н4. Кальций ингибирует фосфорилирование гистонов, особенно гистонов Н1 и Н4. Этот эффект в старческом возрасте уменьшается (рис. 2.6). Эстрадиол стимулирует фосфорилирование гистонов [183], особенно у взрослых животных, но этот эффект в старости исчезает (рис. 2.7). При уменьшении фосфорилирования гистонов может усиливаться их связь с ДНК благодаря уменьшению числа отрицательных зарядов.

Рис. 2.5. Схема проведения in vitro ковалентных модификаций хромосомных белков и модуляции матричной активности хроматина в срезах коры головного мозга крыс

Рис. 2.6. Влияние кальция на включение ³²P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [182].

_{А. Норма. Б. Добавлен Са²⁺}

Рис. 2.7. Влияние эстрадиола на включение ³²P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [183].

_{А. Норма. Б. Добавлен эстрадиол}

Ацетилирование гистонов играет роль в транскрипционной активности хроматина. Показано, что ацетилирование гистонов из мозга крыс с возрастом уменьшается [349]. При этом специфическое уменьшение наблюдается для гистонов Н3 и Н4, а ацетилирование гистона Н1 не меняется. Адреналин стимулирует ацетилирование гистона Н1, а эстрадиол — гистона Н3. Эти модулирующие эффекты в старческом возрасте уменьшаются. Кальций не оказывает значительного влияния на ацетилирование гистонов (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348, 349].

_{А. Норма. Б. Добавлен Са²⁺. В. Добавлен эстрадиол}

Было изучено влияние ацетилирования гистонов и его модуляций, вызываемых бутиратом и эстрадиолом, на функции хроматина из коры головного мозга крыс [184]. Как бутират, так и эстрадиол, добавленные в инкубационную среду, содержащую ¹⁴С-ацетат и срезы головного мозга, стимулировали ацетилирование гистонов у молодых крыс. Этот эффект сильно уменьшался у взрослых особей и вообще не наблюдался у старых животных (110 нед). Если из этих срезов выделяли ядра и использовали их для транскрипции при инкубировании с ³H-UTP и другими нуклеотидтрифосфатами, то наибольшее стимулирование транскрипции наблюдалось у молодых крыс, а у взрослых этот эффект сильно уменьшался. Изучаемые модуляторы ее оказывают никакого влияния на транскрипцию у старых крыс (рис. 2.9). Полученные данные указывают не только на корреляцию между ацетилированием гистонов и транскрипцией хроматина, но и на уменьшение в старческом возрасте модулирующего влияния бутирата и эстрадиола. Это может быть обусловлено структурными и конформационными изменениями хроматина, появляющимися при увеличении возраста.

Рис. 2.9. Включение ³H-UMP в РНК из ацетилированных ядер коры головного мозга крыс-самок разного возраста и действие масляной кислоты и эстрадиола [184].

_{1 — срез; 2 — срез после ацетилирования; 3 — срез после ацетилирования + масляная кислота; 4 — срез после ацетилирования + эстрадиол}

Изучение метилирования гистонов из мозга крыс показало, что эта модификация с возрастом также замедляется, особенно в случае гистонов Н3 и Н4 (рис. 2.10) [348]. Однако метилирование является стабильной модификацией, и поэтому несмотря на то, что с возрастом происходит замедление включения групп ¹⁴СН₃, общее число метальных групп в гистонах увеличивается, так как те группы, которые были введены в более раннем возрасте, уже не удаляются. При метилировании гистонов, особенно при образовании триметиллизиновых остатков гистона Н3, их связь с ДНК усиливается. Эстрадиол стимулирует метилирование гистона Н2В, а кальций — гистона Н3. Эти модуляционные эффекты в старческом возрасте отсутствуют. Ковалентные модификации определенных гистонов специфическими эффекторами, несомненно, меняют не только структуру, но и функции хроматина.