Голодный ген
Шрифт:
Лейблу ценой немалых усилий удалось получить гранты от Университета Рокфеллера и кое-каких других организаций. На эти деньги к работе над проектом были привлечены двое молодых сотрудников — Стримсон С. Чуа, выпускник Колумбийского университета, обладатель двух докторских дипломов, по медицине и философии, и Натан Бахари, студент-медик из Корнеллского университета. Чуа имел опыт исследования генов коров, наследственного материала, близкого к человеческому, а вот молекулярные карты мышей были для него в новинку. Бахари радовал сообразительностью и энтузиазмом, но к изысканиям подобного толка и масштаба приступал впервые. «Мы продолжали пользоваться ценными советами Дуга Колемана, с которым я был в постоянном контакте, — вспоминает Лейбл, — но до многого
За год команда Фридмана-Лейбла проследила ob– и db– гены у тысячи животных и значительно усовершенствовала их генетические карты, но потом сделалось ясно, что маркеров, указывающих направление, безнадежно мало. Требовалось как-то ускорить процесс. Многообещающе выглядел метод микропрепарирования — создания маркеров путем скрупулезного разъединения каждой хромосомы на несколько фрагментов. Всего лишь несколько человек на земном шаре могли справиться со столь сложной техникой, а в США — ни один. Поэтому в 1987 г. Натан Бахари, тогда уже аспирант, отправляется для овладения микропрепарированием в Лондон, в лабораторию биолога Стивена Брауна.
Здесь, в лондонской больнице Святой Марии, за несколько лет до того впервые в истории приступили к освоению этого новейшего метода. «Увлекательное было время! Перспектива позиционного клонирования явственно просматривалась почти повсеместно, его возможные результаты в экспериментах с мышами-мутантами волновали умы», — вспоминает Браун, ныне глава отделов генетики млекопитающих в Медицинском исследовательском центре и Центре генома мышей в Харуэлле, Великобритания.
Микропрепарирование, требующее чрезвычайно точного рассечения хромосом, необыкновенно тонкий и сложный процесс. Бахари подошел к делу основательно. Он собственноручно изготовил лабораторную посуду, набор безупречных игл и пипеток. Клетки мышей Натан выращивал на био-культуре, потом добавлял солевой раствор, чтобы они набухли. Набухший материал выпускался из пипетки на предметное стекло микроскопа с высоты 80-180 см. Упав, клетки от удара лопались и высвобождали хромосомы. Затем предметное стекло надо было перевернуть и поместить под окуляр: теперь при взгляде через микроскоп хорошо различались взвешенные в капельке жидкости хромосомы. Нетрадиционное — и, прямо скажем, ненадежное — положение предметного стекла давало Бахари возможность добраться до них крошечным скальпелем.
Ежедневно проделывая виртуозные манипуляции, Натан четыре месяца провел в лаборатории Брауна, сыром и мрачноватом помещении, находившемся прямо над Паддингтонской линией метрополитена. «Каждый раз, когда слышался грохот поезда, приходилось хватать все, что может упасть, — иначе оно и впрямь упало бы и было бы утеряно», — вспоминает Бахари. Нередко за считанные минуты насмарку шли усилия нескольких дней. Не имея достаточно средств, чтобы снять комнату в отеле, Натан спал на раскладушке в лекционном зале, а душ принимал в больничном бассейне. Постоянно царивший в лаборатории сумрак угнетал, но не лишал энтузиазма: Бахари двигался по пути, который доступен немногим, и понимал это.
«Натан стал настоящим мастером микропрепаривания, это было сродни искусству, — говорит Лейбл. — И надо отдать ему должное: он победил».
Через несколько месяцев после возвращения в Университет Рокфеллера Бахари применил освоенную технику для создания молекулярных клонов, которые были нанесены на генетические карты гибридов, полученных при скрещивании ob– и db– мышей. У этой помеси расстояние между соседними ДНК оказалось еще меньше, чем у родителей. В серии статей, опубликованных в начале 1990-х гг., группа Лейбла-Фридмана изложила предварительные результаты идентификации ob– гена.
Охватившее участников каждодневной изнурительной работы воодушевление омрачалось усугубляющейся нервозностью, и по мере того как росла вероятность успешного клонирования ob–
Фридману казалось, будто Лейбл и научный руководитель последнего, Джулс Хирш, пытаются играть главенствующую роль, отодвигая его, Джеффа, на второй план. Подозрительность росла, и в конце концов Фридман заявил, что Лейбл фактически отстраняет его от проекта, не допуская в лабораторию, где клонируется ob– ген. «Действительно, я имел определенный вес в научных кругах, которые занимаются исследованиями в области ожирения; и именно поэтому мы смогли получить субсидию от Ассоциации национальных институтов здоровья. Но обвинять меня в попытке выдвинуться на первое место и сделать себе рекламу за счет других участников работы было куда как несправедливо», — делится воспоминаниями Лейбл. Как старший, он чувствовал себя особенно ответственным за судьбу проекта и в начале 1993 г. решил положить конец конфликту, отказавшись от повседневного участия в проекте, но сохранив тесные контакты с лабораторией, которая по-прежнему нуждалась в его советах.
К моменту ухода Лейбла группа проработала уже шесть лет и сузила пространство поисков ob– гена до расстояния между двумя маркерами на хромосоме, отсеяв сотни тысяч других возможных предположений. Цель приближалась, но все еще оставалась неуловимой. Примерно за семь месяцев до описываемых событий, в мае 1992 г., Фридман пригласил на работу только что получившую степень доктора философии И-ин Чзан из Медицинской школы Нью-Йоркского университета. Она приехала в Университет Рокфеллера с двухмесячным первенцем, но была готова немедленно включиться в дело.
«Кое-кто считал, что я сошла с ума, собравшись применить позиционное клонирование для обнаружения гена, — говорит И-ин. — Подобные технологии обычно приводили к полному фиаско. Однако сама идея была вполне здравой, и я считала, что у нас есть неплохие шансы».
Для клонирования потенциальной ob– области в наиболее доступном для манипуляций участке ДНК Чзан применяла ту же технику, что и Дон Сейгел — дрожжевую искусственную хромосому (ДИХ). Ее коллега Рикардо Проэнца предложил еще один путь, названный им «отделением экзона». Экзоны — это участки гена, в которых закодирована информация о специфическом белке. Отделяя их от интронов, таких сведений не несущих, Проэнца сократил количество генов-кандидатов на obпримерно до двухсот. Затем Чзан и Фридман сузили область поиска до четырех, лежавших в пределах той зоны ДНК, где, по их ожиданиям, должен был бы располагаться ob– ген.
«Мы уже не сомневались, что он там, и проверили в этой области буквально каждый экспрессированный ген», — говорит Чзан. Экспрессия гена подтверждается наличием информационной РНК (и-РНК), молекулы, имеющей близкое отношение к ДНК: и-РНК транскрибирует и транспортирует копию ДНК, снятую с ее интронов. Слепок этот становится трафаретом для производства белка. В случае с obнормальный белок длиннее видоизмененного, который преждевременно прекращает свое действие и порождает в результате ob– фенотип, иначе говоря, ob– телосложение.