Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3
Шрифт:
В МЭКХ могут применяться как анионные, так и катионные детергенты. Однако наиболее распространены анионные детергенты. Наиболее часто применяется, как уже отмечалось, ДДСН. Меньше подходят гомологи ДДСН. Так, например, расвор децилсульфата натрия с необходимой концентрацией (50 мМ) обладает высокой электропроводностью, что увеличивает поток и, как следствие, возникают проблемы с джоулевым теплом. Тетрадецилсульфат натрия обладает при комнатных температурах слишком малой растворимостью, что ограничивает его применение только высокими температурами. В общем случае сульфаты и сульфонаты предпочтительнее карбоксилатов, поскольку они сохраняют постоянную часть заряда в широкой области pH. В таблице 26 приведены некоторые детергенты со своими КМК и числами агрегирования. Величина ККМ представляет собой минимальную концентрацию детергента, необходимую для образования мицеллы. Под числом агрегирования
Данные относятся к чистой воде. В буферном растворе значения ККМ ниже, а числа агрегирования больше.
В качестве катионных детергентов в основном находят применение аммонийные соли с гидрофобными алкильными цепочками.
Адсорбция молекул детергента на стенках капилляра приводит к обращению направления ЭОП уже при концентрациях несколько ниже ККМ. Вследствие этого анализируемые вещества движутся к аноду. Электрическое поле в данном случае должно налагаться таким образом, чтобы анод находился со стороны детектора. Противоионионного детергента при данной температуре оказывает определенное влияние на ККМ. Например, ДДСН более растворим в воде, чем додецилсульфат калия. Если в буфере присутствуют ионы калия, это может привести к обмену противоионов, в результате чего растворимость детергента может уменьшиться настолько, что ККМ не будет достигаться.
Разрешающая способность в методе МЭКХ определяется аналогично хроматографическому методу:
С учетом подвижности мицелл получим соотношение для разрешающей способности:
Уравнение описывает зависимость разрешающей способности от факторов N, а, k', to/two. Разрешение растет пропорционально квадратному корню из числа тарелок. Чем больше наложенная разность потенциалов, тем число теоретических тарелок больше до тех пор, пока с увеличением переноса вещества в потоке джоулево тепло вырастет не слишком сильно. Среднее число теоретических тарелок для большинства веществ пробы лежит в пределах от 100 до 200 тысяч. Если эффективность заметно ниже, то это означает, что молекулы пробы адсорбируются на стенках капилляра. В этом случае капилляр следует промыть и условия опыта оптимизировать, например, с помощью изменения pH.
Гидрофобные вещества пробы или анализируемые вещества с большими временами миграции дают, как правило, большее число теоретических тарелок вследствие того, что коэффициент диффузии мицелл меньше, чем для анализируемых веществ в буфере. Число теоретических тарелок несущественно зависит от длины капилляра, однако все же при использовании коротких капилляров вводимый объем должен уменьшаться для того, чтобы избежать уширения пиков, вызванного перегрузкой объема.
Селективность а — важнейший фактор, т. к. за счет селективности можно достичь большого улучшения разрешающей способности. Селективность определяется коэффициентами распределения между подвижной и стационарной фазами и, следовательно, зависит от химических свойств разделяемой системы. На разрешающую способность можно воздействовать как изменением состава буфера, так и выбором другого детергента. Методом МЭКХ без труда можно разделить два вещества пробы, обладающие селективностью 1.02. С ростом величины k' разрешающая способность, обусловленная подвижностью стационарной фазы, растет не постоянно, а проходит через максимум. Эта характерная для МЭКХ зависимость представлена на рис. 74. При постоянной селективности расстояния межу максимумами пиков уменьшаются для маленьких и больших значений k'. С помощью расчетов можно показать, что оптимальное значение k' составляет (tMC/to)1/2.
Рис. 74. Зависимость между селективностью и значением k'.
Как и в хроматографии, в МЭКХ значение k' зависит от коэффициента распределения через соотношение фаз:
k' = KVMC/Vaq
k — коэффициент распределения, VMC —
Линейная зависимость между k' и концентрацией детергента при разделении ароматических соединений показана на рис. 75.
Рис. 75. Линейная зависимость между k' и концентрацией детергента. Капилляр 75 мкм, 50/57 см, буфер ДДСН в 50 мМ борате, pH 8.5, напряжение 20 кВ.
Влияние соотношения фаз на разрешение показано на рис. 76.
Рис. 76. Влияние соотношения фаз на разрешение пиков.
Рост соотношения фаз приводит сначала к улучшению разрешающей способности, которая однако при дальнейшем увеличении соотношения фаз ухудшается. В представленных хроматограммах речь идет о расчетных величинах, которые делают этот эффект более наглядным. Вследствие того, что повышение концентрации детергента влияет также на ЭОП, вязкость и ионную силу буфера, на практике хроматограммы выглядят иначе.
Интервал времен миграции молекул пробы дается величинами to и tMC. Чем меньше отношение времен миграции to/tMC, тем больше интервал времен миграции и, тем самым, разрешение. Влияние ЭОП на интервал времен элюирования показан на рис. 77.
Рис. 77. Влияние ЭОП на разделение.
Уменьшение ЭОП приводит к росту интервала времен элюирования и, тем самым, к росту разрешения пиков. Недостатком, однако, является то, что при уменьшении ЭОП резко возрастает время анализа. На практике уменьшение ЭОП достигается добавлением некоторых органических растворителей, например, метанола или изопропанола (<20 %). Другая возможность уменьшения ЭОП состоит в снижении pH буфера.
Изменение поверхности капилляра, например при нанесении покрытия, представляет собой еще одну возможность влияния на ЭОП. Некоторые добавки, такие как производные метилцеллюлозы или этиленгликоль, применяются в КЭ для увеличения вязкости буфера. Увеличение вязкости приводит не только к уменьшению ЭОП, но влияет в одинаковой степени и на электрофоретическую подвижность.
Следовательно, увеличением вязкости невозможно улучшить разрешающую способность.
Увеличение электрофоретической подвижности также может приводить к увеличению интервала времен миграции. Однако этот метод не имеет большого практического значения, т. к. выбором другого детергента можно влиять на селективность. Небольшие изменения селективности могут, особенно при малых а, вызвать большие изменения разрешающей способности. Это, в свою очередь, может свести к нулю и даже обратить эффект повышения разрешения за счет увеличения электрофорети ческой подвижности мицелл.
Ниже более подробно будут рассмотрены факторы, влияющие на селективность. Рост температуры приводит к уменьшению времени миграции, поскольку как коэффициент распределения, так и вязкость при этом уменьшаются. Вследствие того, что температурные зависимости коэффициентов распределения для каждого компонента пробы различаются, селективность изменяется. Несмотря на то, что изменение температуры не очень сильно влияет на селективность, для воспроизводимости анализов и из-за колебаний времени миграции температура должна поддерживаться постоянной. Условий разделения, вызывающих большие потоки, следует избегать, поскольку большие потоки приводят к нагреванию буфера и капилляра. Поэтому выгодно эффективно охлаждать капилляр.