Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3
Шрифт:
Рис. 68. Пример разделения белков в капилляре с ПВП-покрытием.
Буфер: 58.5 мМ фосфат, pH 2.0; пробы: А — бэта-лактогдобулин В, В — бэта-лактоглобулин А, С — лизоцим, D — серумальбумин человека, Е — РНК крупного рогатого скота, F — цитохром С, G — трипсиноген, Н — миоглобин кита, I — трансферрин, J — кональбумин, К —
9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев)
Поли(этиленимин) (ПЭИ) является положительно заряженным полимерным покрытием, которое закрепляется на стенке капилляра под действием электростатических взаимодействий.
Изготовление. Способ нанесения такого покрытия похож на способ нанесения покрытия из анионообменных материалов на полимерные и силикатные подложки для ВЭЖХ: при этом сначала на поверхности носителя адсорбируются первичные ПЭИ с различными ММ и концентрацией, затем производится их поперечное сшивание.
В качестве сшивающего агента служит в данном случае этиленгликольдиглицидилэфир. ПЭИ содержит сдвоенные полимерные цепи с первичными, вторичными и третичными аминогруппами в соотношении 1:2:1. Эти функциональные группы делают возможными как электростатические взаимодействия, так и поперечную сшивку.
Электроосмос. Вследствие того, что концентрация основных аминогрупп в полимере высока, в широкой области pH покрытие остается заряженным положительно, что приводит к обращению направления ЭОП. При этом абсолютные значения элетроосмотических подвижностей, которые для данных покрытий достигаются при низших pH, лежат в той же области, что и скорости потоков для необработанных капилляров при основных pH (!). Подробная ЭОП/pH — характеристика, а также зависимость от количества нанесенного ПЭИ показана на рис. 69.
Рис. 69. Зависимость ЭОП от pH (ЭОП/рН-характеристики) капилляров с нанесенным ПЭИ при различных концентрациях
Как и ожидалось, с ростом значения pH буфера ЭОП увеличивается, т. к. при этом резко ускоряется депротонирование аминогрупп. Кроме того, в данном случае нельзя также полностью влияние поверхностных исключить силанольных групп (депротонирование в щелочи!).
Применимость. Наряду с интересными свойствами по отношению к ЭОП, капилляры, покрытые ПЭИ, пригодны также для разделения белков. (Отталкивание положительно заряженных белков от стенки капилляра!). (Рис. 70).
Рис. 70. Разделение стандартных белков в капилляре, покрытом ПЭИ.
Буфер: 20 мМ гидроксиламин/НС1, pH 7,0: пробы: 1 — мезицилоксид, 2 — миоглобин кита, 3 — БСА, 4 — хямотрипси-моген А крупного рогатого скота, 5 — цитохром С лошади, 6 — лизоцим.
9.3.2.4.
Исходным соединением для изготовления этого полипептидного покрытия является мономер М-карбоксиангидрид гаммаметилглутамата. Сначала проводят адсорбцию этого соединения на стенку капилляра, затем с помощью нагревания с одновременным расщеплением диоксида углерода проводят полимеризацию.
Электроосмос. Вследствие того, что нанесенный полимерный слой очень тонок, 5 ЭОП уменьшается незначительно и стенка капилляра экранируется не полностью.
Применимость. Капилляры с поли(метилглутаматовым) (ПМГ) покрытием пригодны для разделения белков. Кроме того, ими можно разделять комплексные смеси ферментов (рис 71).
Рис. 71. Разделение целлюлозного комплекса ферментов в капилляре с ПМГ-покрытием.
Буфер: 30 мМ фосфат, pH 7,0.
9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ.
Еще на начальной стадии развития в КЭ было предложено использовать капилляры с нанесенными полимерами, применяемые в ГХ. При этом преследовалась цель регулировать ЭОП в МЭКХ с помощью капилляров, покрытых полиметилсилоксаном (ПМС) или ПЭГ.
При использовании неполярного ПМС-покрытия в МЭКХ с ДДСН в качестве мицеллообразователя ЭОП возрастает по сравнению с использованием необработанного капилляра. Это приводит к более коротким временам анализа, но одновременно с этим и к меньшим площадям пиков. Увеличение электроосмоса можно объяснить адсорбцией молекул ПАВ на гидрофобной поверхности и, как следствие, повышением ^-потенциала. В случае полиэтиленгликолевого покрытия наблюдается обратный эффект, т. е. меньшая скорость потока, большие времена анализа и большие площади пиков. Это значит, что такое покрытие экранирует поверхностные силанольные группы, однако, вследствие гидрофильного характера ПЭГ-цепочек, дополнительной адсорбции ДДСН не происходит. Областью применения таких капилляров является разделение фенолов и производных нитробензола, в частности, производного пурина и циклических оснований.
9.4. Выводы
Применение кварцевых капилляров с покрытием для КЭ описаны в последние годы многими авторами. Однако до настоящего времени коммерчески доступны капилляры только с очень ограниченным числом типов покрытий:
1. Applied Biosistems (Foster City, California) предлагают катионные реагенты, которые дают положительно заряженные покрытия и, тем самым, приводят к обращению направления ЭОП. Этими покрытиями также заметно понижаются взаимодействия белков со стенками капилляров при значениях pH ниже их изоэлектрической точки.
2. BioRad (Hercules, California) предлагают капилляры, модифицированные гидрофильными покрытиями. Тем самым, как ЭОП. так и адсорбция биомолекул уменьшаются.
3. Supeico, Inc. (Bellefonte, Pennsylvania) предлагает различные связанные фазы. Тем самым, кроме уменьшения адсорбции белков должно обеспечиваться постоянство ЭОП в области pH от 3 до 10. Предлагаемыми к продаже фазами являются: нейтральные гидрофильные, слабо гидрофобные фазы С1, гидрофобные фазы С8 и сильно гидрофобные фазы С18.