Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1
Шрифт:
Первые две цели имеют значение для решения теоретических вопросов биологии, последние две носят ярко выраженный прикладной характер.
Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений
Одна из целей культивирования растительных клеток — получение важных для медицины и ряда отраслей промышленности веществ. Для того чтобы производство было рентабельным, необходимо культивировать их на простых по составу пита тельных средах. В то же время, среды достаточно сложны по составу и включают в себя витамины, гормоны, источники углеродного питания, так как клетки в культуре
В микробиологии опыт смешанного культивирования есть. Он показывает, что системы микроорганизмов более эффективны, чем монокультуры. Их используют для очистки сточных вод, получения ферментов, биологически активных веществ (ауксины, витамины, антибиотики). Считается, что в биотехнологии найдут применение смешанные популяции, включающие в себя как сочетания нескольких штаммов микроорганизмов, так и представителей царств растений и животных.
Улучшение сельскохозяйственных растений предполагает получение растений, способных к фиксации молекулярного азота.
При внесении удобрений используется от 30 до 50 % внесенного азота. Другой путь поступления азота — биологическая фиксация молекулярного азота. Большая часть осуществляется азотфиксирующими симбионтами, но этот процесс характерен лишь для некоторых видов высших растений и микроорганизмов. Для повышения доли биологической фиксации азота используют 3 подхода:
1. Инокуляция азотфиксирующими микроорганизмами (бактериальные удобрения). Недостаток — низкая выживаемость интродуцируемых чистых культур и вытеснение их естественной почвенной микрофлорой.
2. Создание азотфиксирующих растений методами генной инженерии. При этом предлагается вводить гены nif в протопласты высших растений. Препятствия на этом пути: процесс требует большого количества энергии, которой нет в растительной клетке, нет также систем транспорта, запасов железа и молибдена, необходимых для синтеза нитрогеназы, нет систем защиты нитрогеназы от инактивации кислородом.
3. Введение целых азотфиксирующих организмов в растения. Такие ассоциации должны учитывать особенности организации природных азотфиксирующих симбиозов:
— целостность обоих партнеров,
— интеграция партнеров в пределах организма макросимбионта,
— относительная обособленность макросимбионта.
С помощью клеточной инженерии можно осуществить жизнедеятельность азотфиксирующих организмов в клетках и тканях культурных растений. При этом возможна проверка большого числа сочетаний партнеров. В процессе культивирования возможна также адаптация партнеров друг к другу. Кроме того, бактериальные симбионты могут быть интегрированы в ткани растений с сохранением их интактности, что позволит оградить нитрогеназу от кислорода, выделяемого растением в процессе фотосинтеза.
В настоящее время эти положения могут быть подтверждены рядом экспериментов.
Создание эндосимбиотических ассоциаций
В изолированные протопласты растений вводили микроорганизмы следующих систематических групп: бактерии, дрожжи, цианобактерии,
Существует несколько способов введения микроорганизмов в протопласты (рис. 25):
Рис. 25. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты высших растений
(по L. Folke, O.Gamborg, 1981)
1. Эндоцитоз (инвагинация плазмалеммы), при этом везикула с микроорганизмом высвобождается в цитоплазме протопласта.
2. Интеграция (слияние) мембран протопласта и микроорганизма, органеллы водорослей высвобождаются в цитоплазму протопласта, но при этом они не окружены плазмалеммой протопласта.
3. Заключение микроорганизма в искусственные мембраны — липосомы. Например, в протопласты лука вводили цианобактерии, заключенные в липидные капли.
Каждый из методов имеет свои достоинства и недостатки. В первом случае везикулы окружены цитоплазматической мембраной протопласта, в результате чего может произойти слияние с лизосомами и разрушение микроорганизма.
Во втором случае происходит нарушение целостности микроорганизма: в цитоплазме оказываются органеллы.
а) эндоцитоз (поглощение путем инвагинации мембраны)
б) слияние мембран
в) слияние мембраны протопласта с липосомой
В третьем случае в цитоплазме оказываются интактные микроорганизмы, что является одним из условий воспроизведения естественного симбиоза. Такого же результата можно достичь используя метод микроинъекций (например — цианобактерий) в пространство между стенкой и плазмолированной клеткой лука. Этот способ можно рассматривать либо как стадию перед попаданием бактерий в цитоплазму, либо как получение ассоциаций межклеточного типа.
К сожалению, жизнеспособных систем на основе изолированных протопластов в настоящее время не получено, так как в процессе культивирования происходило разрушение либо микроорганизма, либо протопласта. Необходимы дальнейшие исследования.
Экзосимбиотические ассоциации
Партнеры те же, в основном — азотфиксаторы (Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum), Chlorella и различные виды грибов. Общий принцип создания таких ассоциаций — совместное культивирование клеток растений с микроорганизмами. Способы ведения микроорганизмов в культуру могут быть различны: внесение микроорганизмов непосредственно в культуру; высев на поверхности агара рядом с каллусом, но без соприкосновения; разделение бактериальных клеток и культуры мембранами, обеспечивающими обмен продуктами метаболизма, но не допускающими контакта между партнерами.
Рассмотрим результаты попыток создания ассоциаций с различными партнерами.
Ассоциации с клубеньковыми бактериями
Сначала создавались упрощенные модельные системы для изучения симбиоза бобовых растений с клетками растений. Каллусную ткань сои инфицировали клетками Rhizobium. Были получены подобия инфекционных нитей и бактероидов в каллусной клетке. В таких ассоциациях клетки бактерий проявляли нитрогеназную активность (НГА, отсутствующую в чистой культуре. Это свидетельствовало о процессе азотфиксации.